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Design of Experiment (DoE) für Fed-Batch Prozessentwicklung in geschüttelten Kulturen

Bestimmung der Reporduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Escherichia coli Kulturen unter Fed-Batch Bedingungen mittels SensorDish® Reader und Sensor Flasks

F. Glauche, N. Cruz, A. Knepper, M. Föllmer, S. Junne, P. Neubauer
Labor für Bioverfahrenstechnik, Institut für Biotechnologie, TU Berlin, Deutschland

Bei der Entwicklung eines rekombinanten Proteinproduktionsprozesses muss eine große Anzahl paralleler Kultivierungen durchgeführt werden. Dies wird meistens unter Verwendung von Batch-Kulturen in Schüttelkolben oder Mikrotiterplatten gemacht, wo die Fermentationsbedingungen nicht überwacht werden. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurden der SensorDish® Reader und der Shake Flask Reader mit dem enzymatischen Glucose-Zufuhrsystem (EnBase®) für Escherichia coli Kultivierungen kombiniert. Es zeigte sich, dass SensorDish®-Kulturen reproduzierbare Prozessdaten lieferten und die Ergebnisse direkt mit dem Schüttelkolben-Maßstab vergleichbar waren

Eine konsequente Prozessentwicklung vom Mikroliter- bis zum industriellen Maßstab, insbesondere in der Biotech-Industrie, erfordert die Berücksichtigung vieler verschiedener Aspekte, um den Übergangsprozess komplett zu verstehen. In dieser Studie wurde ein DoE erstellt, um optimale Parameter für zwei verschiedenen Kultivierungs-Maßstäbe zu bestimmen. Derartige Batch-Kultivierungen in orbital geschüttelten Systemen (meist Schüttelkolben, aber auch Mikrowellplatten und Fermenter im Labormaßstab) werden verwendet, um mit möglichst geringem Aufwand akzeptable Ergebnisse zu erzielen. Leider wird dabei der entscheidende Einflusses der Bedingungen bei der Großproduktion, auf die Qualität des Produkts und die Ausbeute des Verfahrens, nicht berücksichtigt. Die wichtigsten Parameter, die im Screening- und Labormaßstab vernachlässigt werden, sind: 1) der Fed-Batch Betrieb, bei dem die Dosierung der Kohlenstoffquelle und der pH-Wert kontrolliert werden, und 2) die Konzentrationsgradienten, verursacht durch große Volumina, unzureichende Rühr- / Misch-Kapazität und Betriebskostenreduzierung. Batch-Prozesse im Labormaßstab haben hohe Anfangskonzentrationen der Kohlenstoffquelle und der pH-Wert kann sich im Laufe der Zeit ändern. Darüber hinaus zeigen Schüttelkolbenkulturen unbedeutende Konzentrationsgradienten im Medium, die das Studium des Bakterienwachstums unter sich schnell ändernden Bedingungen behindern (z. B. Glukosepulse). Bei Mikrotiterplatten werden nur wenige Informationen erzeugt und die oben genannten Einschränkungen bestehen ebenfalls. Darüber hinaus ist die Probennahme sowie die Hochpräzisionsanalyse aufgrund der geringen Volumina begrenzt. Es ist daher wichtig, das tatsächliche Limit jedes Maßstabs (Mikrowell, Kolben, Minireaktor, Großreaktor) sowie seine Beziehung zu allen anderen Schritten in der Produktentwicklungskette zu verstehen. Darüber hinaus ist es wichtig, zuverlässige mathematische, analytische, Überwachungs- und Kontrollmethoden zu schaffen, um die Informationen zwischen den verschiedenen Phasen zu übertragen. In dieser Arbeit wird ein Vergleich von Fed-Batch Kultivierungen in zwei verschiedenen Maßstäben, nämlich 24-Well-Platten (3,3 ml) und Schüttelkolben (125 ml), verglichen. Dazu wird die PreSens Fluoreszenzsensorik eingesetzt, um sowohl gelösten Sauerstoff als auch pH-Wert in der Kultur online zu überwachen (Abb. 1). Auf diese Weise soll eine mathematische Beziehung zwischen Mikro- und Milliliter-Maßstab entwickelt werden. Dieser Ansatz sollte ein besseres Design von Schüttelkolbenexperimenten ermöglichen, basierend auf Informationen, die zuvor im Well-Platten-Maßstab erhalten wurden.

Material & Methoden

Um Substrat-limitierte Fed-Batch Kultivierungen in Platten und Kolben durchzuführen, wurde das enzymatische Glukose-Zufuhrsystem EnBase® (BioSilta) verwendet. EnBase® emuliert die Glukosezufuhr, indem es Glukose aus einem Polysaccharid mittels einer enzymatischen Reaktion freisetzt. Die Zufuhr von Glukose in der Kultur kann mit der Menge des Enzyms EnZ, das zugegeben wird, kontrolliert werden. Ziel der Versuche war die Bestimmung des optimalen Volumens und der Enzymkonzentration für Platten und Kolben. Ein D-optimaler Versuchsplan wurde mit MODDE (Umetrics) erstellt, mit den Faktoren Enzym (EnZ I'm) -Konzentration (0 bis 30 U/l) und Volumen (0,5 bis 2,1 ml in 24-Well-Platten, 7 bis 15 ml in Kolben). Die optische Dichte wurde als Antwort gewählt. 11 Tests wurden mit unterschiedlichen Volumina und Enzymkonzentrationen für die zwei verschiedenen Maßstäbe durchgeführt: 24-Well OxoDishes® und HydroDishes® mit dem SDR SensorDish® Reader-Messsystem und Schüttelkolben, die mit pH- und DO-Fluoreszenzsensoren ausgestattet waren und mit dem SFR Shake Flask Reader ausgelesen wurden. Die SensorDishes® wurden mit "System Duetz" Sandwich-Abdeckungen und Klemmsystemen (EnzyScreen) kombiniert. Zusätzlich zu den Online-Messungen von pH und DO wurde das Bakterienwachstum in einem Spektrophotometer bei 600 nm (OD600) gemessen. Die enzymatische Zufuhr wurde mit EnPresso®-Medium (BioSilta) durchgeführt, das gemäß der Beschreibung des Herstellers hergestellt und mit E. coli BL21-Zellen inokuliert wurde; die anfängliche OD600 der Kulturen lag zwischen 0,1 und 0,3. Während der gesamten Kultivierung wurden pH und DO kontinuierlich in den Mikrowellplatten und in den Schüttelkolben überwacht, um konstante Bedingungen ohne Sauerstofflimitierung und einen pH-Wert zwischen 5 und 7,5 zu gewährleisten. Die Übernachtkulturen wurden in zweistündigen Intervallen von den jeweiligen Lesern genommen, um die optische Dichte OD600 zu bestimmen.

Vergleich von SDR und SFR

Wie in Abbildung 2 dargestellt ist, zeigen alle Kurven für gelösten Sauerstoff die charakteristischen Trends einer substratlimitierten Fed-Batch Kultur. Die Konzentration des Enzyms ist während jedes Experiments konstant; dies induziert eine quasi konstante Zufuhr von Glukose während der Kultivierung. In der ersten Phase führt die niedrige Zelldichte zu einer verringerten Gesamtglukoseaufnahmekapazität, was eine Glukoseakkumulation ermöglichte, die eine Anfangsphase des exponentiellen Wachstums induzierte. Der schnelle Anstieg der Atmungskapazität der Bakterien wurde durch den beschleunigten Abfall der DOT-Kurve angezeigt. Die Abnahme der pH-Werte zeigte die Sekretion von sauren Verbindungen, hauptsächlich Essigsäure. Die zweite Phase war durch Substratbeschränkung gekennzeichnet. Überschüssige Glukose wurde verbraucht und Zellen waren gezwungen, ihre Wachstumsrate und die Atmung zu verringern, um sich an die neuen Bedingungen anzupassen. Wie in Abbildung 2 dargestellt ist, hängt die anfängliche Abnahme von DOT, die mit dem SDR sowie dem SFR aufgezeichnet wurde, von der Menge an Glukose freisetzendem Enzym ab, die der Kultur zugesetzt wurde. So konnte eine optimale Menge an Enzym für schnelles aerobes Wachstum bestimmt werden (Abb. 2 A - C). Wie erwartet, erlaubten Kulturen im Schüttelkolben einen besseren Sauerstofftransfer, so dass die Enzymkonzentrationen auf bis zu 23,3 U l-1 erhöht werden konnten, ohne Sauerstofflimitierung zu erreichen. Die Trends der SDR-Experimente konnten im Schüttelkolbensystem reproduziert werden; ein ähnliches DOT- und pH-Profil wurde aufgezeichnet (Abb. 2 D - F). Außerdem wurde die Reproduzierbarkeit der Kulturen demonstriert. Variationen zwischen verschiedenen Wells und verschiedenen Kulturen waren statistisch nicht signifikant (Daten nicht gezeigt).

Zusammenfassung

DOT und pH sind essentielle Messgrößen für die Überwachung des Kulturzustands in der Bioproduktion. Die Möglichkeit, sowohl DOT als auch pH bereits in frühen Entwicklungsstadien wie Screening-Experimenten in Mikrotiterplatten und Schüttelkolben zu überwachen, ist ein großer Schritt in Richtung schnellerer Bioprozessentwicklung. Die Kombination dieser neuen Messgeräte mit den entsprechenden Modellen zur Überwachung und Vergrößerung ermöglicht einen effizienteren Informationsfluss zwischen kleinem und mittlerem Maßstab. Die Screening-Effizienz wird erhöht, indem das Zellwachstum unter aeroben, Substrat-limitierten und pH-stabilisierenden Bedingungen möglich wird. Kontrollierte Fed-Batch Kultivierungen erlauben nicht nur eine höhere Produktbildung, sondern auch eine höhere Ähnlichkeit zu Produktionsbedingungen in großem Maßstab.

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