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Eine neue Methode zur Vorhersage der Sauerstoffversorgung während aeroben Wachstums

Messungen mit dem SFR Shake Flask Reader ermöglichen die kLa-Bestimmung und zuverlässige Gestaltung der Kultivierungsbedingungen in Einweg-Schüttelkolben

S. Schiefelbein1, A. Fröhlich1, G. T. John2, F. Beutler2, C. Wittmann1, und J. Becker1
1Institut für Bioverfahrenstechnik, Technische Universität Braunschweig, Deutschland
2PreSens Precision Sensing GmbH, Deutschland

Gelöster Sauerstoff (DO) ist ein Schlüsselparameter während der aeroben Kultivierung, und aufgrund seiner geringen Löslichkeit kann Sauerstoff unter bestimmten Kulturbedingungen limitiert sein. In dieser Studie wurde eine neue Methode zur Vorhersage der Sauerstofftransferrate, Sauerstoffsättigung und maximalen Zellkonzentration unter verschiedenen Kulturbedingungen in Einweg-Schüttelkolben entwickelt. Dafür wurden neue mathematische Korrelationen zur Bestimmung des volumetrischen Gas-Flüssigkeits-Stoffübergangskoeffizienten (kLa) aus Füllvolumen, Gefäßgröße und Schüttelgeschwindigkeit ermittelt. Sauerstoffmessungen wurden mit dem SFR Shake Flask Reader durchgeführt. Nach Tests mit Corynebacterium glutamicum konnte gezeigt werden, dass mit dieser neuen Methode eine zuverlässige Gestaltung der Kulturbedingungen erreicht und eine Vorhersage über die maximal mögliche Zellkonzentrationen ohne Limitierung getroffen werden konnten.

Schüttelkolben haben mehrere Vorteile, wie z. B. einfache Handhabung und hohen Durchsatz und werden daher in Forschung und Industrie häufig eingesetzt. Aus diesem Grund wurden die Konzentration von gelöstem Sauerstoff und der Stoffaustausch in Schüttelkolben bereits in mehreren Studien untersucht. Diese Information wurde jedoch nie für vorläufige Überlegungen beim Versuchsaufbau oder die Vorhersage von DO in aerober Kultivierung verwendet, obwohl dies von signifikantem Vorteil wäre und ein Versagen aufgrund von Sauerstoffmangel verhindern würde. In dieser Studie entwickelten wir eine Methode zur zuverlässigen Vorhersage der Sauerstoffsättigung während aeroben Wachstums. Da es einen wachsenden Markt für Einweg-Kulturbehälter mit integrierten Sensoren gibt, konzentrierten sich unsere Experimente auf diese Art von Kunststoff-Schüttelkolben. Wir führten eine systematische Untersuchung von kLa in Einweg-Schüttelkolben mit und ohne Schikanen durch, und die Sauerstoffüberwachung wurde mit dem SFR Shake Flask Reader durchgeführt, der eine Online-Überwachung in den Gefäßen ermöglichte. Die resultierenden mathematischen Korrelationen für die kLa-Berechnung wurden dann bei einer Modellkultivierung mit C. glutamicum verwendet, und die maximale Zellkonzentration, die ohne Sauerstofflimitierung erhalten werden könnte, wurde vorher bestimmt.

Material & Methoden

kLa wurde in Schüttelkolben mit und ohne Schikanen, unterschiedlicher Größe (125, 250, 500 ml) und mit integrierten Sauerstoff- und pH-Sensoren (SFS Sensor Flasks, PreSens) quantifiziert. Die Messungen wurden in 100 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) bei 30 und 37 °C in einem Orbitalschüttler mit einem Schütteldurchmesser von 50 mm durchgeführt. Für die DO-Überwachung verwendeten wir den SFR Shake Flask Reader (PreSens). Die Schüttelkolben wurden mit Puffer und Co(NO3)2 (0,1 mM) äquilibriert. Die vollständige Sauerstoffabreicherung wurde durch Zugabe von 200 g l-1 Na2SO3-Stammlösung erreicht. Die Arbeitsvolumina (10 - 40 % maximales Füllvolumen) und Schüttelfrequenzen (50, 150, 250 UpM) wurden variiert und alle Messungen wurden dreifach durchgeführt. kLa wurde unter Verwendung von Berkley MADONNA (Ver. 8.0.1) zwischen 20 und 90 % der Sauerstoffsättigung bestimmt. Für die kLa-Schätzung wurden empirische Korrelationen zwischen Kolbengröße, Schüttelfrequenz und kLa basierend auf experimentellen Daten zusammengestellt. Die mathematische Anpassung verwendete entweder die Gauß-Funktion oder die Parabolfunktion [1]. C. glutamicum ATCC 13032 wurde mit Mineralsalzmedium kultiviert. Die Kulturen wurden in 250 ml Schüttelkolben mit Schikanen (SFS, PreSens) bei 30 °C und 150 U/min mit einem Füllvolumen von entweder 10 oder 30 % gezüchtet. Letzteres wurde verwendet, um die spezifische Wachstumsrate und die spezifische Sauerstoffaufnahmerate zu bestimmen. Diese experimentell bestimmten Werte für Wachstum und Sauerstoffaufnahme wurden verwendet, um den Anstieg der Biomassekonzentration und die Abnahme von DO während des Wachstums von C. glutamicum bei 30 °C, 150 U/min in 250 ml Schüttelkolben bei 10 % Füllvolumen vorherzusagen.

kLa Quantifizierung in Schüttelkolben

kLa wurde durch Online-Sauerstoffüberwachung in mit Puffer gefüllten Schüttelkolben mit und ohne Schikanen bestimmt. Sauerstoff wurde vollständig durch Zugabe von Na2SO3 zu dem System entfernt. Als die durch Co2+ katalysierte Redoxreaktion abgeschlossen war, erhöhte sich der gelöste Sauerstoff in den Kolben, was zur Bestimmung von kLa für die gegebenen Bedingungen verwendet werden konnte. Für die untersuchten Schüttelkolben wurden bemerkenswert hohe kLa-Werte von bis zu 350 h-1 ermittelt. Für Schüttelkolben ohne Schikanen war der kLa im Allgemeinen niedriger, mit max. kLa-Werten von 100 h-1 [1]. Die Schüttelfrequenz hatte den signifikantesten Einfluss auf den Sauerstofftransfer. Die Gefäßgröße hatte kaum einen statistisch relevanten Einfluss auf den kLa von Kolben ohne Schikanen, zeigte jedoch eine gewisse Wirkung auf kLa in Schikanenkolben. Ein Temperaturanstieg von 30 auf 37 °C hat den kLa kaum beeinflusst. Dennoch wurde für jedes untersuchte Füllvolumen eine individuelle Korrelation für 30 und 37 °C ermittelt. In Abb. 2 ist dies für Schüttelkolben mit Schikanen bei 30 °C mit 10 % Füllvolumen gezeigt. Eine optimale Parameterschätzung konnte durch Gauß-Anpassung der kLa-Werte für Schikanenkolben und parabolische Anpassung von kLa-Werten für Kolben ohne Schikanen erreicht werden.

Wachstum und Sauerstoffverbrauch von C. glutamicum

Abbildung 3A zeigt das Wachstum und den Sauerstoffverbrauch von C. glutamicum Kultur in 250 ml Schüttelkolben bei 30 % Füllvolumen und 150 U/min Schüttelfrequenz. Dabei wurde beobachtet, dass DO sehr schnell abfiel und nach 4 Stunden limitierend wurde. Wachstum und Sauerstoffaufnahme wurden zu 0,38 h-1 bzw. 14,2 mmol g-1 h-1 bestimmt. Diese Werte wurden verwendet, um den zeitlichen Verlauf des Zellwachstums und des DO für C. glutamicum Kultivierung bei einem anderen, bisher nicht getesteten Zustand vorherzusagen. Dazu führten wir Berechnungen für einen Versuchsaufbau in 250 ml Schüttelkolben mit Schikanen mit 10 % Füllvolumen und einer Schüttelfrequenz von 150 U/min durch. kLa wurde auf 190 h-1 berechnet und mit einer Inokulumkonzentration von 0,2 g CDW l-1 wurde der zeitliche Verlauf des Zellwachstums bestimmt, wie in Abbildung 3 B dargestellt ist (durchgezogene blaue Linie); unter Berücksichtigung aller Parameter wurde DO berechnet (gestrichelte blaue Linie). Bei der Durchführung des Experiments und der Überwachung der Kulturleistung konnte nachgewiesen werden, dass der Sauerstoffverbrauch tatsächlich gut prognostiziert worden war. Experimentelle und vorhergesagte Werte waren fast identisch. Die erwartete Zellkonzentration bei limitierender Sauerstoffzufuhr (4,3 g l-1) stimmte auch mit den experimentell erreichten Zellkonzentrationen von 4,6 ± 0,3 g l-1 bei DO von 20 % überein.

Zusammenfassung

Die Ergebnisse dieser Studie zeigen deutlich, dass diese Methode angewendet werden kann, um optimale Kulturbedingungen und Sauerstoffverbrauch in Einweg-Schüttelkolben vorherzusagen. Mit den ermittelten Korrelationen kann die kLa-Berechnung vom pufferbasierten System auf die Standard-Schüttelkolbenkultur übertragen werden. Die Möglichkeit, die Sauerstoffverfügbarkeit für bestimmte Versuchsanordnungen vorherzusagen, kann das Design of Experiment erheblich verbessern. Das SFR-System wurde speziell für die Sauerstoffüberwachung in Einweg-Schüttelkolben entwickelt und erwies sich bei dieser Untersuchung als ein wertvolles Werkzeug, das die grundlegenden Daten für die Entwicklung dieser neuen Methode und deren spätere Verifizierung lieferte.

Applikationsbericht nach
[1] S. Schiefelbein et al., Biotechnol Lett, 2013: Oxygen supply in disposable shake-flasks: prediction of oxygen transfer rate, oxygen saturation and maximum cell concentration during aerobic growth.

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