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Genauer Einblick in den Sauerstoffgehalt von Schüttelkolben
Michael Findeis und Gernot T. John
PreSens GmbH, 93053 Regensburg, Deutschland
Zahlreiche Faktoren beeinflussen das Wachstum von Zellkulturen in Schüttelkolben. Der freie Sauerstoffgehalt spielt eine entscheidende Rolle. Unzureichender Sauerstoffeintrag aus der Umgebung schränkt das Wachstum ein. Mit dem neuen SFR-Messsystem kann der gelöste Sauerstoffgehalt des Mediums nicht-invasiv und äußerst genau bestimmt werden. Kontinuierliche Sauerstoffüberwachung bietet Vorteile für die Kultivierung neuer empfindlicher Zelllinien, für die Medienoptimierung und für die QA-bezogene Prozesskontrolle.
Berührungslose Sauerstoffmessung
Schlüsselparameter in der aeroben Zellkultur sind der gelöste Sauerstoffgehalt und der pH-Wert des Mediums, die beide die Kulturqualität entscheidend beeinflussen. Die beiden Werte verändern sich im Verlauf der Zellkultur durch Sauerstoffverbrauch, und Ansäuerung des Mediums durch Stoffwechselprodukte. Die kontinuierliche Überwachung von Sauerstoffverbrauch und pH-Wert ist für die Optimierung von Zellkulturprozessen von Vorteil. Wenn bestimmte Grenzwerte überschritten werden, können entsprechende Korrekturen, wie z.B. schnelle Medienwechsel oder Veränderung des Sauerstoffpartialdruckes, vorgenommen werden. Zuverlässige Informationen über den Stoffwechselzustand der Kultur sind essentiell für die Qualitätssicherung. Die berührungslose Messung von Sauerstoffgehalt und pH-Wert mittels nicht-invasiven optischen Sensoren (1) steht nun auch für Schüttelkulturen zur Verfügung (Abb. 1), wodurch eine nachhaltige Verbesserung des Prozesses möglich ist. Das optoelektronische SFR-Messgerät basiert auf chemisch-optischen Sensoren. Im Gegensatz zu den Vorgängersystemen bietet die neue SFR-Technik eine kombinierte Messung von DO und pH. Das Messprinzip des Sauerstoffsensors beruht auf der selektiven Aufzeichnung einfacher Sensorlumineszenz. Im pH-Sensor wird die Lumineszenz mittels eines dualen Signals mit einem zusätzlichen integrierten Referenzsensor detektiert. Das Sensorauslesen erfolgt mit modulierten Signalen, so dass Störungen durch farbige Medien und Fremdkörper vermieden werden können. Die SFR-Ausleseeinheit besteht aus neun optischen Modulen zur gleichzeitigen Messung beider Parameter. Das System ist für Schüttelkolben mit 125, 250, 500, 1000, 2000, 3000 und 5000 ml Volumen geeignet. Das Komplettsystem kann einfach auf das Tray eines Standard-Schüttlers montiert werden und passt somit in die meisten Schüttel-Vorrichtungen. Messdaten werden kabellos in Echtzeit übertragen. Da alle Systemkomponenten vorkalibriert sind, ist keine weitere Kalibrierung vor Ort erforderlich.
Pilotstudie mit Hefezellen
Eine Pilotstudie an Hefezellkulturen demonstriert die Leistungsfähigkeit der neuen Messtechnik. Von besonderem Interesse ist der Einfluss unterschiedlicher Schüttelfrequenzen und Füllvolumina auf den Sauerstoffgehalt während der dynamischen Wachstumsphase.
Dynamische Wachstumsphase
Die Änderung der Schüttelfrequenz beeinflusst den gelösten Sauerstoffgehalt (DO) der Probe. Ein einfacher Testaufbau mit stufenweiser Erhöhung der Schüttelfrequenz über einen Zeitraum von zwei Stunden zeigte dies deutlich (Abb. 4). Ab dem Grundwert von 100 U / min wurde die Frequenz alle 15 Minuten um 25 U / min erhöht. Nachdem die maximale Frequenz von 300 U / min erreicht worden war, wurde die Inkubation bei 100 U / min fortgesetzt. Das Schüttelprogramm begann, als der optische Dichtegradient ΔOD 0,4 erreichte, um sicher zu stellen, dass die Messreihe während der exponentiellen Wachstumsphase aufgezeichnet wurde (Abb. 4). Um die Wirkung des Füllvolumens auf den DO-Gehalt parallel zu bestimmen, wurden Messungen in Schüttelkolben (250 ml) mit unterschiedlichen Füllvolumina (12,5, 25 und 50 ml) durchgeführt. Die Ergebnisse für identische Proben (n = 3) stimmten gut überein. Jede Zunahme der Schüttelfrequenz (Abb. 3b) führte zu einer beträchtlichen Zunahme des DO-Gehalts, was bei Proben mit einem Füllvolumen von 50 ml am stärksten und bei niedrigeren Füllvolumina weniger ausgeprägt war. Nach jeder Frequenzerhöhung hatte sich der DO innerhalb weniger Minuten auf ein neues höheres Niveau eingependelt - allerdings nur für kurze Zeit, bevor er wieder abfiel. Diese Beobachtung lässt sich darauf zurückführen, dass ein neues Gleichgewicht zwischen der Menge an zugeführtem Sauerstoff und dem von der Kultur verbrauchten Sauerstoff schnell erreicht wurde.
Verbesserter Kultivierungsprozess
Das SFR-System ist ein ideales Werkzeug zur schnellen und berührungslosen Bestimmung des zellspezifischen Sauerstoffmetabolismus. Auch bei langen Messreihen und hohen Schüttelfrequenzen können verlässliche Aussagen über DO-Veränderungen in der Kultur über die Zeit gemacht werden. Dies gilt in gleicher Weise für die Online-Messung des pH-Wertes. Bei komplexen Kultivierungsvorgängen sorgt diese Überwachungsfunktion für maximale Zuverlässigkeit und verbessert die Prozesseffizienz. Die durchgeführte Pilotstudie zeigt das große Potenzial und die Vielzahl möglicher Anwendungen einer Online-Sauerstoffbestimmung. Der Vorteil liegt darin, dass das Kultivierungssystem für die Messung nicht gestört werden muss. Dadurch wird die O2-Übertragung zu den Zellen nicht unterbrochen, und vorübergehend anaerobe Bedingungen können vermieden werden. Schlussfolgerungen, die zur weiteren Optimierung des Kultursystems herangezogen werden können - hinsichtlich Schüttelfrequenz, Probenvolumen, erforderlicher Kulturdauer, Medienzusammensetzung, Medienwechselzeiten, optimalen Erntezeiten und möglicherweise auch metabolisch bedingten Hemmungsmechanismen in der Kultur durch Nebenprodukte – können direkt aus den Messdaten entnommen werden. Das nicht-invasive Messprinzip hat auch besondere Vorteile für die Kultur von Vertebraten-Zelllinien. Es reduziert das Kontaminationsrisiko. Der SFR ist ein effektives Werkzeug für die kostengünstige Entwicklung neuer Zelllinien, für zuverlässige Screening-Prozesse, Medienoptimierung und Vorversuche im Rahmen des Prozess-Scale-Ups.
1. Karin Benz und Jürgen Mollenhauer (2008), Quality Assessment in 3D Cultures of Disc-Chondrocytes: Optosensoric Online Monitoring of Oxygen and pH Kinetics, BioProcess International Vol. 6 (11), pp. 54 - 59.