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Imaging des Sauerstoffverbrauchs mikrobieller Kulturen

Überwachung der metabolischen Aktivität von E. coli im Inkubator mit VisiSens™ A1

H. Tschiersch1, G. Liebsch2, L. Borisjuk1, A. Stangelmayer2, H. Rolletschek1
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Abteilung Molekulare Genetik, Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK), Gatersleben, Deutschland
2PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Deutschland

Sauerstoff-Imaging mit VisiSens™ A1 ermöglicht eine zweidimensionale Kartierung des Sauerstoffverbrauchs in mikrobiellen Kulturen. Das kompakte Messsystem kann zur Überwachung der Stoffwechselaktivität direkt im Inkubator eingesetzt werden. Als ein Beispiel wurden Escherichia coli Kulturen auf Agar untersucht, um die Fähigkeiten des Imaginggerätes zur Visualisierung von Sauerstoffgradienten über die Kulturoberfläche zu demonstrieren. Die Ergebnisse zeigen deutlich, wie sich Sauerstoffgradienten um einzelne Kulturen herum entwickeln und wie sich der Sauerstoffgehalt in Abhängigkeit von der Entfernung zu anderen Kulturen im Laufe der Zeit verringert.

Mikrobielle und Zell- / Gewebekultivierungen haben große Bedeutung und sind wichtige Werkzeuge in der biologischen und medizinischen Forschung oder Biotechnologie. Kenntnisse über die lokale metabolische Aktivität von Zellen und Strukturen in Kolonien können dabei helfen, komplexe Wachstumsprozesse zu verstehen und zu kontrollieren. Ein Schlüsselparameter bei der Kultivierungskontrolle ist Sauerstoff. Sauerstoffverbrauch oder -produktion kann wertvolle Informationen über den Stoffwechselstatus einer Kultur liefern. Präzise Sauerstoffmesssysteme sind daher unverzichtbar. Konventionelle Messtechniken wie z. B. Elektroden erlauben nur Einzelpunktmessungen, die keine räumlichen Information über Sauerstoffverteilungen in der Probe liefern. Selbst die Durchführung von Transekt-Messungen mit Sauerstoff-Mikrosensoren kann diese Einschränkung nicht vollständig überwinden. Das VisiSens™ A1-System kombiniert planare fluoreszierende Sensorfolien mit Digitalkameratechnologie und ermöglicht nun eine zweidimensionale Bewertung der Sauerstoffverteilung über die Probenoberflächen. Die fluoreszierenden Sensorfolien sind nicht toxisch und verbrauchen während des Messvorgangs keinen Sauerstoff. Informationen über einen ganzen Bereich können mit µm Auflösung über ausgedehnte Messperioden aufgezeichnet werden. Die Sensorfolien werden berührungslos mit einem kompakten Fluoreszenzmikroskop ausgelesen. Es kann leicht in einem Inkubator installiert werden und wird von außen über PC oder Notebook gesteuert (Abb. 1). Die Möglichkeit, Veränderungen des Sauerstoffpartialdrucks aufgrund von Stoffwechsel- und Diffusionsprozessen zu visualisieren und zu bewerten, macht VisiSens™ zum idealen Werkzeug für die Zell- und Gewebekulturüberwachung. Wir haben diese Messtechnik zur Untersuchung der Sauerstoffverteilung in verschiedenen Pflanzengeweben getestet und auch in einer nicht-pflanzlichen Anwendung ausprobiert. In dem hier beschriebenen Experiment wurde E. coli als Modellorganismus verwendet. Die Kultur wurde mit dem VisiSens™ A1-System im Inkubator überwacht und der Sauerstoffverbrauch einzelner Bakterienkolonien visualisiert.

Material & Methoden

Zu Beginn und am Ende des Experiments wurde die VisiSens™ Sauerstoffsensorfolie (SF-RPSu4, PreSens, Regensburg) kalibriert, indem Bilder sowohl einer Natriumsulfitlösung (0% Luftsättigung) als auch von luftgesättigtem destilliertem Wasser (100% Luftsättigung) aufgezeichnet wurden. Wir züchteten E. coli Kolonien auf einer Agarplatte und legten die Sensorfolie direkt auf die Kultur. Die VisiSens™ Detektoreinheit (DU01, PreSens) wurde im Inkubator installiert und von außen mit einem Laptop gesteuert. Die Steuerung der Detektoreinheit und die anschließende Bildanalyse wurden mit der VisiSens™ AnalytiCal 1 Software durchgeführt. Wir starteten die Bildaufnahme unmittelbar nachdem die Kultur in den Inkubator gestellt worden war; für eine Inkubationszeit von 20 Minuten wurden Bilder im Abstand von 30 s aufgenommen.

Imaging von E. coli Kolonien

Kurzzeitinkubation (5 - 20 min) mit dem Sauerstoffsensor ergab klare Sauerstoffverteilungsbilder, wobei einzelne Kolonien anhand ihres Sauerstoffverbrauchs identifiziert werden konnten (Abb. 3). Die Sauerstoffkonzentration nahm im Bereich der Kolonien innerhalb von 20 min rasch ab (Abb. 4 + 5). Die Sauerstoffbilder zeigen weiter, wie die Sauerstoffabnahme von der Entfernung zu anderen Kolonien abhängt (Abb. 4). Durch Diffusion und damit Sauerstoffverbrauch mehrerer benachbarter E. coli Kolonien änderte sich auch der Sauerstoffgehalt im Medium mit der Zeit (Abb. 6).

Zusammenfassung

VisiSens™ ist in der Lage, verschiedene Stellen innerhalb einer Multiwell-Platte oder Petrischale zu visualisieren. In mikrobieller Kultur ist es möglich, den Sauerstoffverbrauch einzelner Kolonien zu unterscheiden. Durch die Visualisierung von Sauerstoffverteilungen über eine ganze Probenfläche und ihrer zeitlichen Veränderungen können wertvolle Informationen gewonnen werden. Diese lassen sich zur Überwachung des Stoffwechsels oder zur Modulation der Sauerstoffversorgung nutzen, um bestimmte Prozesse in der Zell- oder Gewebekultur besser zu steuern. Die Verwendung von VisiSens™ erleichtert die Untersuchung der Respirationsdynamik und wird zu einem besseren Verständnis in vielen Anwendungsbereichen beitragen, wie z. B. dem Screening von Respirationsphänotypen in Hefe.

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