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Korrektur der Sauerstoffdiffusion bei Respirationsmessungen
Bestimmung der momentanen Sauerstoffverbrauchsrate in OxoDishes®, die als geschlossene Respirometer verwendet werden
E. T. Polymeropoulos1,2, N. G. Elliott2, S. J. Wotherspoon3, P. B. Frappell1,3
1School of Zoology, University of Tasmania, AU
2Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation (CSIRO), National Food Futures Flagship, CSIRO Marine and Atmospheric Research, AU
3Institute for Marine and Antarctic Studies, University of Tasmania, AU
Wenn Multiwell-Platten aus Polystyrol - wie die PreSens OxoDishes® - als geschlossene Respirometer verwendet werden, muss man auch die Sauerstoffdiffusion durch das Wellmaterial berücksichtigen, da Polystyrol für Sauerstoff durchlässig ist. Hier geben wir eine Gleichung an, mit der die empirisch ermittelte Geschwindigkeit der Sauerstoffdiffusion durch Polystyrol bei der Berechnung der augenblicklichen Sauerstoffverbrauchsrate berücksichtig wird. Die Sauerstoffdiffusion aus den Wells eines OxoDishes® wurde experimentell bei verschiedenen Temperaturen mit dem SDR SensorDish® Reader bestimmt. Die gesammelten Daten konnten verwendet werden, um die Diffusionskonstante k für die OxoDishes® vorherzusagen.
Multiwell-Platten oder Glasfläschchen mit integrierten chemisch-optischen Sensoren (Optoden) werden zunehmend für aquatische Respirometrie bei Kleintieren eingesetzt. Sie sind preiswert, ihr Volumen ist ideal für diese Art von Studie, und ihre Anwendung ermöglicht die gleichzeitige Messung von Replikaten. Seit einigen Jahren werden chemisch-optische Sensoren gegenüber früher verwendeten Elektroden vom Clark-Typ bevorzugt, da die Optoden keinen Sauerstoff verbrauchen, wenig Wartung erfordern und stabilere Messungen liefern. Der SDR SensorDish® Reader ist ein solches optisches Sauerstoff-Messsystem, das oft in der Respirometrie eingesetzt wird. Mit diesem Reader können die Sensoren am Boden jedes Wells in einem OxoDish® - einer Polystyrol-Multiwellplatte mit integrierten Optoden - ausgelesen werden. Idealerweise können durch eine Respirometerkammer keine Gase diffundieren. Da Polystyrol jedoch sauerstoffdurchlässig ist, diffundiert O2 bei Verwendung eines OxoDishes® durch die Wände der Wells, wenn der darin enthaltene pO2 unter den pO2 der Umgebung sinkt. Um genaue Messungen der Sauerstoffverbrauchsrate R (in mmol min-1) von Zellen oder ganzen Tieren innerhalb der OxoDishes® durchzuführen, muss die Diffusion in die versiegelten Wells berücksichtigt werden.
Momentane O2-Verbrauchsrate
R wird aus Änderungen der Sauerstoffkonzentration abgeleitet, die das Produkt des Kapazitätskoeffizienten für Sauerstoff ßO2 (in mmol l-1 kPa-1, der von der Temperatur abhängt) und seines Partialdrucks pO2 (in kPa) ist. Der Organismus im Respirometer verbraucht O2 mit einer momentanen Rate R (t). Im infinitesimalen Zeitintervall (t, t + Δt) verbraucht der Organismus eine Anzahl von Molen O2, R (t) Δt. Wir nehmen an, dass die Medien innerhalb und außerhalb des Wells gründlich durchmischt sind, und PW (t) der pO2 im Well zum Zeitpunkt t und PA der konstante pO2 außerhalb des Wells ist. Nach dem Fick'schen Gesetz ist der Diffusionsfluss proportional zum Gradienten (PA - PW (t)) über die Oberfläche, und die Erhaltung von O2 erfordert, dass die Veränderung der Mole von O2 im Well die Mole von O2, die durch Diffusion nachgeliefert oder verloren werden, sowie die Mole an verbrauchtem O2 ausgleicht:
Dabei ist V das Volumen des Wells und k die Diffusionskonstante. Diese Differentialgleichung hat die Lösung:
τ ist eine Dummy-Variable der Integration und e-k (t-τ) ist ein integrierender Faktor. In Abwesenheit des Organismus ist R (t) = 0 und
damit
k kann aus der Steigung einer Auftragung von log (IPW (t) - PAI) gegen die Zeit bestimmt werden. Bei Überwachung von PW (t) und dPW / dt, kann R (t) geschätzt werden aus
Gemäß Gleichung 5 wird dPW / dt verwendet, um R zu bestimmen. Während der Datenerfassung muss ein Gleichgewicht zwischen Signalrauschen und Abtastfrequenz vorhanden sein, um eine geeignete Auflösung zu erhalten und gleichzeitig eine Zunahme des Rauschens zu überwinden. Eine Alternative wäre es, eine Beziehung zu den Daten von pO2 gegen die Zeit zu erstellen, aus der dann zu jedem Zeitpunkt eine Differenz berechnet werden kann, um Rauschen effektiv aus den Daten zu glätten.
Sauerstoffdiffusion durch die Wände von Polystyrol-Wells
Jedes Well eines OxoDishes® hat ein Volumen von etwa 3,3 ml, und eine Optode ist am Boden des Wells angebracht. Wenn es als mehrfaches, geschlossenes Respirometer verwendet wird, muss das Medium in jeder Vertiefung gründlich gemischt werden. Daher setzten wir eine Edelstahlkugel (2 mm Durchmesser) in jede Vertiefung, die sich um den Sauerstoffsensor herumbewegte, wenn das OxoDish® auf einen Orbitalschüttler gesetzt wurde. Der untersuchte Organismus wurde durch ein Gitter vom Sauerstoffsensor und der Stahlkugel getrennt. Dann wurde jede Vertiefung einzeln mit einem Glasdeckglas verschlossen (Abb. 1). Um die Sauerstoffdiffusion über die Oberfläche der Polystyrol-Wells eines OxoDish® zu untersuchen, füllten wir 12 Wells mit luftäquilibriertem reinem Wasser (pO2 = 21 kPa). Weitere vier Wells wurden mit Sauerstoff-freiem Medium (1 % Natriumsulfit-Lösung, pO2 = 0) als Kontrolle für die Drift des Sauerstoffsensors gefüllt. Jedes Well wurde unter Ausschluss von Luftblasen verschlossen und das OxoDish® auf dem SDR SensorDish® Reader positioniert. Das gesamte System wurde dann in einer anoxischen (stickstoffgespülten) und temperaturkontrollierten Umgebung auf einen Orbitalschüttler (75 U/min) gestellt. Sauerstoffmessungen wurden in einem Abstand von 1 Minute bei 8 °, 22,5 ° bzw. 37 °C durchgeführt, bis ein pO2 von etwa 5 kPa erreicht war. Als Kontrolle, bei der keine Sauerstoffdiffusion stattfindet, wurde eine maßgefertigte 24-Well Platte aus Aluminium mit Glasboden verwendet, bei der in jedem Well ein Sensorspot (SP-PSt5, PreSens) integiert war, um die Messungen mit dem selben Aufbau zu wiederholen. O2 diffundierte über die Wände des OxoDish® und der pO2 im Wasser in den Wells nahm mit der Zeit exponentiell ab. Die Änderung des pO2 im Laufe der Zeit war bei erhöhter Temperatur größer, wie in Abb. 2 zu sehen ist. In der nicht diffusionsfähigen Aluminiumplatte blieb der Sauerstoffgehalt innerhalb der Vertiefungen dagegen über die gleiche Zeitspanne konstant. Eine Auftragung von log (IPW (t) - PAI) gegen die Zeit, wobei in diesem Fall PA = 0 war, zeigte gerade Linien und Steigungen, die den k-Werten für die jeweiligen Temperaturen entsprechen. Es besteht eine lineare Beziehung zwischen k und Temperatur, so dass bei einer gegebenen Temperatur der k-Wert für die Polystyrol-OxoDishes® vorhergesagt werden kann.
Zusammenfassung
Plastik-Multiwellplatten mit integrierten Sauerstoffsensoren, wie die OxoDishes® von PreSens, können zuverlässig als kleine, geschlossene Respirometer eingesetzt werden, vorausgesetzt, dass die Diffusion von O2 durch die Wände der Wells berücksichtigt wird. Mit dem hier vorgestellten Verfahren können die Daten um diesen Fehler korrigiert werden. Mit der Beziehung zwischen der Diffusionskonstante k und der Temperatur kann dieses Verfahren auf verschiedene experimentelle Bedingungen angewendet werden.
Applikationsbericht nach
E. T. Polymeropoulos, et al.: Respirometry: Correcting for Diffusion and Validating the Use of Plastic Multiwell Plates with Integrated Optodes; Physiological and Biochemical Zoology 86 (5), 588 - 592, 2013