Messung von Sauerstoffgradienten über einer respiratiorisch aktiven Algenzellschicht

Einsatz von VisiSens™ zur Erkennung dynamischer Sauerstoffluktuationen über die Zeit

Sauerstoffgradienten in Pufferlösung oberhalb einer Monoschicht von Chlamydomonas reinhardtii wurden mit dem VisiSens™ System visualisiert. Ziel des Experiments war es, zu bestimmen, ob atmende Zellen in der Lage sind, ihre Sauerstoffverbrauchsrate an die Sauerstoffverfügbarkeit in ihrer Umgebung  anzupassen. Die Zellen wurden sowohl unterschiedlichen Sauerstoffkonzentrationen ausgesetzt als auch in Pufferlösungen mit entweder hohen oder niedrigen Acetatkonzentrationen gehalten. Die 2D-Bilder, die mit VisiSens™ im Laufe der Zeit aufgenommen wurden, deuten darauf hin, dass der Sauerstoffverbrauch durch Atmung mit unterschiedlichen Sauerstoffkonzentrationen in der Zellumgebung variieren kann. Es wurde jedoch festgestellt, dass die Nährstoffverfügbarkeit einen viel stärkeren Einfluss auf die Zellen hat als die Sauerstoffverfügbarkeit.

Molekularer Sauerstoff ist ein wesentliches Substrat für die Produktion von Atmungsenergie (ATP). Wenn die Verfügbarkeit von Sauerstoff für eine Zelle zu gering wird, behindert dies die ATP Produktion und kann schließlich zum Tod der Zelle führen. Obwohl Pflanzen in der Lage sind, Sauerstoff bei Licht durch Photosynthese selbst zu produzieren, sind Pflanzenzellen sehr anfällig für Sauerstoffmangel. Da Pflanzen kein effizientes Verteilungssystem haben, um Sauerstoff zu den Geweben zu transportieren, in denen er am meisten benötigt wird, können interne Sauerstoffkonzentrationen in Pflanzen auf sehr niedrige Niveaus fallen.
Es wird beschrieben, dass Pflanzen mehrere adaptive metabolische Reaktionen auf Sauerstoffarmut besitzen. Die Aktivität des energieverbrauchenden Speicherstoffwechsels wird herunterreguliert, und metabolische Flüsse werden auf die ökonomischsten Abläufe umgestellt. Als Folge dieser metabolischen Anpassungen kann die Produktionsrate von ATP reduziert und der Sauerstoffbedarf der Zellatmung verringert werden. Gegenwärtig wird diskutiert, ob diese Reduktion des Sauerstoffverbrauchs bei Hypoxie eine direkte Folge des Sauerstoffmangels ist, oder ob proaktive Regulationsmechanismen vorhanden sind, um Sauerstoff zu sparen und zu verhindern, dass die Zellen anoxisch (d. h. völlige Abwesenheit von Sauerstoff) werden. Voraussetzung für eine proaktive Regulierung des Sauerstoffverbrauchs ist ein zellulärer Mechanismus zur Bestimmung der Sauerstoffverfügbarkeit. Tatsächlich wurde kürzlich ein Sensor oder Signalweg für die Verfügbarkeit von molekularem Sauerstoff in Pflanzenzellen entdeckt. Es muss jedoch noch der experimentelle Nachweis erbracht werden, dass Pflanzenzellen Sauerstoff sparen können, indem sie ihren Verbrauch während Perioden geringer Sauerstoffverfügbarkeit reduzieren.
Da es nicht möglich ist, die wahre Sauerstoffkonzentration in und um multizelluläre Pflanzengewebe zu bestimmen, ohne das Gewebe zu beschädigen, haben wir uns entschieden, für diese Experimente eine flüssige Zellkultur der Alge Chlamydomonas reinhardtii zu verwenden. Die VisiSens™ Sensorfolie wurde an der Innenseite des Testgefäßes angebracht, um Sauerstofffluktuationen im Medium über den Zellen zu bestimmen und zu untersuchen, ob atmende Pflanzenzellen in der Lage sind, ihre Sauerstoffverbrauchsrate an variierende Sauerstoffverfügbarkeit in ihrer Umgebung anzupassen.

Material & Methoden

Zellen eines unbeweglichen Stammes der Grünalge Chlamydomonas rheinhardtii wurden in zwei gerade Glasfläschchen pipettiert. Innerhalb von etwa 4 Stunden bauten die Zellen eine homogene Zellschicht am Boden der Flasche auf. Der Überstand wurde vorsichtig abpipettiert und durch einen Puffer mit entweder hoher oder niedriger Acetatkonzentration als Atmungssubstrat ersetzt. Die Testfläschchen wurden im Dunkeln und  in einen transparenten Plastikbeutel platziert, der mit vorgemischter Luft gefüllt werden konnte, die unterschiedliche Sauerstoffkonzentrationen enthielt (siehe Abb. 1). Die Sauerstoffkonzentration in der Puffersäule über den Zellen wurde kontinuierlich unter Verwendung eines kleinen Streifens VisiSens™ Sauerstoff-Sensorfolie überwacht, die an der Innenseite des Glasfläschchens angebracht war (siehe Abb. 2). Es wurden Sauerstoffkonzentrationen von 21 % (v / v) und 4 % (v / v) über den Luftstrom eingespeist und Messungen über 24 Stunden durchgeführt.

Innerhalb der Puffersäule über der Algenzellschicht bildete sich ein Sauerstoffgradient, wenn die Sauerstoffkonzentration in der Luft um die Glasfläschchen bei 21 % (v/v) gehalten wurde (siehe Abb. 3A). Die Stärke des Gradienten korrelierte nicht mit der Kohlenhydratnährstoffkonzentration in der Pufferlösung. Wenn jedoch die Sauerstoffkonzentration um die Flasche herum auf 4 % (v / v) verringert wurde, fiel die Sauerstoffkonzentration im Puffer schnell ab und eine homogene Sauerstoffverteilung in der gesamten Flasche konnte aufgezeichnet werden. Interessanterweise blieb die Sauerstoffkonzentration in der Flasche, die mit einer niedrigen Acetatkonzentration versorgt wurde, höher als in der Flasche mit hoher Acetatkonzentration. Offensichtlich führte die niedrige Nährstoffkonzentration in Verbindung mit niedrigen Sauerstoffniveaus hier zu einer verringerten Sauerstoffverbrauchsrate im Vergleich zu den Zellen mit einer hohen Nährstoffverfügbarkeit.

Zusammenfassung

Aus diesem Experiment kann gefolgert werden, dass die Rate des Sauerstoffverbrauchs durch Atmung abhängig von den Umweltbedingungen variieren kann, aber die Nährstoffverfügbarkeit einen stärkeren Einfluss als die Verfügbarkeit von Sauerstoff hat. Das VisiSens™ System ermöglichte die Visualisierung von Sauerstoffkonzentrationen oberhalb der Algenzellschicht und die aufgenommenen Bilder erlaubten erste Rückschlüsse auf den Sauerstoffverbrauch in Pflanzenzellen. Das Gerät ist einfach anzuwenden und kann bei der Untersuchung der Sauerstoffverbrauchsraten in Pflanzenzellen wertvolle Daten liefern. Besonders die Möglichkeit, Veränderungen nicht nur über längere Zeiträume, sondern auch zweidimensional zu überwachen, ist ein großer Vorteil.