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Online pH-Messungen in iTube pH Bioreaktoren

Evaluierung des ITR iTube96Readers zur Überwachung des Wachstums von Insektenzellkulturen für die Biopestizidproduktion

Ina Dittler1, Gernot T. John2, und Regine Eibl1
1Züricher Hochschule für Angewandte Wissenschaften, School of Life Sciences and Faciltiy Management, Institut für Biotechnologie, Wädenswil, Schweiz
2PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Deutschland

In unseren Experimenten testeten wir TubeSpin50 Bioreaktoren mit integrierten pH-Sensoren (sogenannte iTube pH Bioreaktoren). Wir haben untersucht, ob sie für die Kultivierung von Lymantria dispar Ld652Y-RH-Suspensionszellen geeignet sind. Darüber hinaus wurde die Genauigkeit des ITR iTube96Reader getestet, der eine parallele online pH-Überwachung in bis zu 96 iTubes pH ermöglicht. Die online gemessenen pH-Werte, die mit dem ITR gesammelt wurden, wurden mit offline pH-Messungen eines Benchtop-pH-Meters (Mettler Toledo) verglichen. Schließlich bestimmten wir täglich das Zellwachstum und die Lebensfähigkeit während einer Kultivierungsdauer von 11 Tagen. Die Analyse der Proben ergab eine erwartete Spitzenzelldichte von 3,0 × 106 Zellen ml-1 und Lebensfähigkeiten über 92 % der Insektenzellen in den Zellkulturröhrchen. Online und offline gemessene pH-Werte zeigten eine sehr gute Übereinstimmung (Abweichung unter ± 1 %).

Insektenzellen und das Baculovirus-Expressionsvektorsystem (BEVS) werden zunehmend zur Herstellung von Biopharmazeutika und Biopestiziden verwendet. Verglichen mit Säugetierzellkulturen sind Insektenzellen leichter und billiger zu kultivieren. Außerdem benötigen ihre Produkte weniger Produktionszeit und können in einer Umgebung mit geringer Sicherheitsstufe (Stufe 1) gehandhabt werden [1]. Die Insektenzellen wachsen bei einer Temperatur von ca. 27 °C und haben eine höhere Toleranz gegenüber Osmolarität oder Nebenproduktkonzentrationen. Sie benötigen kein zusätzliches CO2 und vertragen pH-Werte zwischen 6,0 und 6,8. Für Screening-Studien und Prozessentwicklung auf der Basis von Insektenzellen und dem BEVS werden von verschiedenen Autoren [z. B. 2] TubeSpin50 Bioreaktoren (Techno Plastic Products AG) empfohlen. PreSens hat diese kleinen Bioreaktoren mit nicht-invasiven pH-Sensoren (iTubes pH) ausgestattet. In unseren Experimenten testeten wir iTubes pH zum ersten Mal auf ihre Eignung, den pH-Wert in einer L. dispar-Modellzelllinie zu überwachen. Der entsprechende ITR iTube96Reader, der direkt im Schüttel-Inkubator platziert wurde, ermöglichte parallele pH-Messungen in bis zu 96 iTubes pH. Das Auslesen der Sensoren in den Röhrchen wurde mit der ITR-Software gesteuert und aufgezeichnet. Um das ITR-Überwachungssystem zu evaluieren, verglichen wir Online-Werte, die mit dem Gerät gemessen wurden, mit Offline-Messungen, die mit einem Benchtop-pH-Meter durchgeführt wurden. Für die Analyse des Zellwachstum, nahmen wir täglich Proben, um die gesamte und die lebensfähige Zelldichte (TCD, VCD), die Lebensfähigkeit sowie die Substrat- und Metabolitenkonzentrationen zu bestimmen.

Material & Methoden

Wir arbeiteten mit der Zelllinie Ld652Y-RH, die von Prof. Dr. James Slavicek (U.S. Forest Service, USA) zur Verfügung gestellt wurde. Die Zellen für das Inokulum und die Batch-Kultivierung wurden in modifiziertem ExCell420 (Sigma-Aldrich) Insektenzellmedium mit 5 % Serum Plus Media Supplement (Sigma-Aldrich) und 50 μg l-1 Gentamicin-Lösung (Sigma Aldrich) vermehrt. Das Inokulum wurde in einem TubeSpin600 Bioreaktor (Techno Plastic Products AG) bei einem maximalen Arbeitsvolumen von 200 ml und einer Ausgangs-VCD von 0,5 × 106 Zellen ml-1 hergestellt. Es wurde in einem Schüttler (Infors HT Multitron) bei 180 U/min und 25 mm Schütteldurchmesser inkubiert. Am 6. Tag erreichte die Kultur eine VCD von 1,4 × 106 Zellen ml-1 (exponentielle Phase) und wurde mit einer anfänglichen VCD von 0,2 × 106 Zellen ml-1 in die iTubes geimpft. Vor dem Aussäen wurden die pH-Sensoren für 3 Stunden mit 5 ml Medium äquilibriert. Die inokulierten iTubes pH wurden in einer Halterung auf dem ITR platziert, welches via Bluetooth mit dem Computer und der entsprechenden Reader-Software verbunden war. Die Zellen wurden in den iTubes mit einem Arbeitsvolumen von 20 ml bei 27 °C und 250 U/min kultiviert. Über einen Versuchszeitraum von 11 Tagen wurden täglich zwei iTubes pH (Doppelbestimmung) für die Offline-Analyse entnommen. TCD, VCD sowie Lebensfähigkeit wurden mit NucleoCounter 100 (Sysmex) bestimmt. Die Substrat- und Metabolitkonzentrationen wurden mit dem automatischen Analysegerät BioProfile 100 Plus (Labor-Systeme Flückinger AG) quantifiziert. Neben online pH-Messungen wurde der offline pH-Wert mit einem pH-Meter (Mettler Toledo) gemessen, das vor jeder Messung mit Puffer pH 4.01 und pH 7.0 kalibriert wurde.

Insektenzellkultur in iTubes pH

Die tägliche Probenahme und Offline-Datenanalyse von Ld652Y-RH-Zellen, die in iTubes pH kultiviert wurden, zeigte Wachstum und Lebensfähigkeit (Abb. 2A) wie erwartet. Die Lebendzelldichte (VDC) erhöhte sich innerhalb von 8 Tagen auf etwa 3,0 × 106 Zellen ml-1. Dann gingen die Kulturen in eine stationäre Phase über, während VCD leicht abnahm (11%). Eine Lebensfähigkeit von über 92 % konnte für 5 Tage beibehalten werden und blieb über 85 % bis zum 9. Tag der Kultivierung. Die maximale Wachstumsrate und Verdopplungszeit für die exponentielle Phase wurde zu 0,021 h-1 und 33,2 h berechnet. Die erhaltene Zellzahl stimmt gut mit den Daten überein, die für die LdFB-Zelllinie in 250 ml Schüttelkolben beobachtet wurden [3]. Eine niedrigere maximale VCD von LdElta (1,5 × 106 Zellen ml-1) wurde von Betenbaugh et al. [4] beschrieben, wobei die maximale Wachstumsrate von etwa 0,019 - 0,024 h-1 und die maximale Verdopplungszeit von 28 - 35 h gut mit unseren Ergebnissen vergleichbar sind. Die Abbildungen 2B und C zeigen das Metabolitenprofil von Ld 652Y-RH-Zellen, das ähnlich dem der Spodoptera frugiperda-Zellinie Sf-9 ist. Die Glukosekonzentration nahm innerhalb von 11 Tagen kontinuierlich von anfänglich 7,3 g l-1 auf 4,0 g l-1 ab. Die Konzentrationen von Glutamin nahmen während der exponentiellen Phase von 3,8 mmol l-1 auf 2,2 mmol l-1 ab und stiegen in der stationären Phase und der Sterbephase auf 3,2 mmol l-1 an. Die maximale Ammoniumkonzentration von 2,6 mmol l-1 wurde am Tag 1 gemessen und nahm bis zum 11. Tag auf 0,7 mmol l-1 ab. Die pH-Werte in der L. dispar-Zellkultur gingen bis zum 9. Tag konstant von pH 6,5 auf 5,9 zurück (Abb. 2C). Als das Wachstum aufhörte und die Anzahl lebensfähiger Zellen abnahm (Abb. 2A), stieg der pH-Wert wieder leicht an (3 %, Abb. 2D). Der Vergleich der online mit dem ITR gemessenen pH-Werte (Abb. 3) mit Offline-Werten der täglichen Probenahme zeigte eine gute Übereinstimmung mit einer Abweichung von weniger als ± 1 %. Dies zeigt, dass mit dem ITR eine genaue pH-Überwachung während L. dispar-basierter Prozesse durchgeführt werden kann.

Zusammenfassung

Die Funktion des ITR iTube96Reader in Kombination mit iTubes pH mit integrierten, nicht-invasiven Sensoren wurde für die Lymantria dispar Zelllinie Ld 652Y-RH in einem pH-Bereich zwischen 5,9 und 6,5 erfolgreich evaluiert. Während der Kultivierung lieferte das ITR-System stabile pH-Messungen (± 1 %) ohne funktionelle oder technische Probleme.

Danksagung
Die Autoren möchten sich bei Prof. Dr. James Slavicek (U.S. Forest Service, USA) für die Bereitstellung der L. dispar-Zelllinie und bei Nancy Hayes-Plazolles (U.S. Forest Service, USA) für die technische Unterstützung bedanken.

Referenzen
[1] R. Eibl, et al. (2014), in Disposable Bioreactors II, Springer, 99 - 125
[2] M. J. De Jesus, et al. (2004), Biochemical Engineering Journal 17, 217 - 223
[3] J. Vaughn, and F. Fan (1997), In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 33, 479 - 482
[4] M. J. Betenbaugh, et al. (1991), Biotechnology Progress. 7, 462 - 467

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