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Online-Überwachung von Glukose, pH und DO in Schüttelkolbenkultur

Neuartiger Glukosesensor in Kombination mit dem SFR Shake Flask Reader

I. Bauer1, G. T. John2, S. Spichiger3, und U. E. Spichiger-Keller3
1Züricher Hochschule für Angewandte Wissenschaften, School of Life Sciences and Facility Management, Fachstelle Bioverfahrens- und Zellkulturtechnik, Waedenswil, Schweiz
2PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Deutschland
3C-CIT AG, Waedenswil, Schweiz

Ein neuer Single-Use Glukosesensor in Kombination mit chemisch-optischen Sauerstoff- und pH-Sensoren wurde zur Online-Überwachung von CHO-Zellkulturen in Schüttelkolben eingesetzt. Während des gesamten Prozesses wurden auch Offline-Messungen durchgeführt. Es zeigte sich, dass der optimale Erntezeitpunkt für die Kultur sehr viel früher war, als bisher aus Offline-Werten abgeleitet wurde. Diese Studie zeigte einen Unterschied in Offline- und Online-Werten, verursacht durch Zeitunterschied und Umweltbedingungen.

Die FDA ermutigt Hersteller, Prozessanalysetools als effektive und innovative Ansätze bei der Entwicklung und Qualitätssicherung zu verwenden. Die hier beschriebenen Sensoren ermöglichen eine verbesserte Überwachung kritischer Kulturparameter während des Prozesses. Neuartige Single-Use Glukosesensoren (CITSens Bio, C-CIT, Wädenswil) nutzen einen enzymatischen Oxidationsprozess und einen direkten Elektronentransfer von Glukose zur Elektrode durch einen chemischen Schaltungsprozess. Während andere enzymatische Glukosesensoren Querempfindlichkeit gegenüber Sauerstoff zeigen, ist dies bei dem neuen Sensortyp nicht der Fall. Zur Trennung vom Kultivierungsmedium bedeckt eine Dialysemembran den Sensorkopf. Diese Sensoren sind in den Belüftungskappen der Schüttelkolben integriert (Abb. 1). Für die hier beschriebenen Experimente wurden die Glukosesensoren zusammen mit SFS Sensorkolben von PreSens mit chemisch-optischen Sauerstoff- und pH-Sensoren verwendet. Die optischen Sensoren werden mit dem SFR Shake Flask Reader, der im Inkubator installiert ist, nicht-invasiv durch den Boden der Kolben ausgelesen. Beide Sensorsysteme ermöglichen eine drahtlose Datenübertragung zu einem PC, so dass Online-Daten ohne Störungen aufgezeichnet werden können, da ein Öffnen der Inkubatortür und das Entnehmen der Schüttelkolben zur Probennahme nicht notwendig ist.

Material & Methoden

Drei 125 ml Schüttelkolben mit integrierten pO2- und pH-Sensoren wurden in diesen Experimenten verwendet. Jeder war mit einem in der Belüftungskappe des Kolbens integrierten Glukosesensor von C-CIT ausgestattet. Zellkulturmedium (ChoMaster® HP-1, Cell Culture Technologies LLC) wurde mit CHO-Zellen inokuliert und in die Kolben gefüllt. Die anfängliche lebensfähige Zelldichte betrug 0,64 × 105 Zellen ml-1 bei 97 % Lebensfähigkeit. Zu Beginn betrug die Glucosekonzentration 3,59 g l-1, gemessen mit einem enzymatischen Offline-Analysator (BioProfile®, Nova Biomedical Corporation) und 4,05 g l-1, gemessen mit HPLC. Aus praktischen Gründen wurden die Glukosesensoren in einer einfachen Ein-Punkt-Kalibrierung entsprechend dem Wert des enzymatischen Analysators bei 3,6 g l-1 kalibriert. Während des gesamten Experiments wurden die Proben auch offline analysiert. Für die ersten 4 Tage wurden die Zellen bei 37 °C inkubiert, um Zellmasse zu erzeugen. Nach einem Medienwechsel zum Produktionsmedium am 4. Tag wurde die Temperatur auf 31 °C reduziert, um die Proteinproduktion für die nächsten 6 Tage zu induzieren.

Online- gegen Offline-Analysedaten

Die Ausgangs-Glucosekonzentration, gemessen mittels HPLC (4,05 g l-1) und enzymatischem Analysator (3,59 g l-1), zeigte eine Differenz von 12,5 %. Da die Glukosesensoren gemäß den Werten des enzymatischen Analysators kalibriert wurden, zeigten die Inline-Glukosesensoren Anfangswerte von 3,6 g l-1. Einer der Glukosesensoren zeigte nach 4 Tagen etwas höhere Werte, aber alle Sensoren zeigten den gleichen Glukoseverbrauch (Abb. 2). Der mit den Offline-Methoden gemessene Unterschied in den anfänglichen Glukosewerten von 0,5 g zeigt, wie schwierig es ist, zuverlässige Glukosemessungen durchzuführen. Abhängig von der verwendeten Methode, Stichproben und Zeitdifferenzen bis zur Analyse können die Werte verfälscht werden. Aus diesem Grund ist die Offline-Glukosemessung möglicherweise nicht zur Prozesskontrolle geeignet. Das gleiche konnte für die pH-Messung beobachtet werden. Die Offline-Messung zeigte einen anfänglichen pH-Wert von 8,1, während die Online-Werte, die mit den chemischen optischen Sensoren am Boden jedes Kolbens gemessen wurden, 7,2 bis 7,3 betrugen. Dieser Unterschied resultiert aus unterschiedlichen Umgebungsbedingungen während der Messung. Die Inkubatoratmosphäre ist auf eine CO2-Konzentration von 5 % v/v eingestellt. CO2 muss in den Medien ins Gleichgewicht kommen, und der endgültige pH-Wert wird erst erreicht, nachdem die Zellkulturmedien einige Minuten im Brutschrank aufbewahrt werden. Aus diesem Grund unterscheiden sich Offline-Werte, die in einer Laborumgebung genommen werden, von Online-Werten. Die Online-Messung spiegelt immer die reale Situation wider. In den ersten vier Tagen zeigten sich die drei typischen Wachstumsphasen in den Daten aller drei Sensoren (Glukose, pH und pO2, Abb. 3). Während der ersten 10 Stunden gab es eine deutliche Lag-Phase, in der sich die Steigung aller drei Sensoren von der Steigung während der folgenden exponentiellen Wachstumsphase unterschied. In den nächsten 36 - 42 Stunden zeigte der Online - Sauerstoffsensor die erhöhte Sauerstoffaufnahme während des exponentiellen Wachstums, wonach die Werte während der Produktionsphase wieder anstiegen, da der Sauerstofftransfer in die Medien den Sauerstoffverbrauch der Zellen überstieg (Abb. 4). Aus Erfahrung und externer Probenanalyse wurde angenommen, dass die Zellkultur mindestens 72 Stunden benötigt, um die maximale Zelldichte mit einem hohen Anteil an lebenden Zellen zu erreichen. In diesem Test zeigten die Online-Sensoren den optimalen Erntezeitpunkt nach ca. 45 Stunden an. Die verwendeten Medien veränderten sich leicht, was zu einem schnelleren Zellwachstum führte. Durch einen zeitgesteuerten Prozess oder manuelle Stichproben wäre diese Änderungen möglicherweise nie entdeckt und viel Produktionszeit verschwendet worden.

Zusammenfassung

Der Einsatz von Online-Glukosesensoren in Kombination mit chemisch-optischen pH- und pO2-Sensoren ermöglichte die kontinuierliche Überwachung dieser wichtigen Prozessparameter in Schüttelkolbenkulturen. Die Ergebnisse dieser Tests zeigen die Wirksamkeit der Online-Überwachungsgeräte zur Kontrolle der Prozessqualität. Im Vergleich zu Offline-Methoden bieten diese Sensoren viele Vorteile, da keine manuelle Probenahme erforderlich ist, das Kontaminationsrisiko reduziert wird und keine Reagenzienkosten anfallen wie bei Batch-Analysatoren. Änderungen im Prozess können sofort erkannt werden. Die Online-DO-Messung und die Glukosemessung zeigen präzise Stoffwechselveränderungen in der Kultur. Mit den integrierten Sensoren können Messungen unter realen Bedingungen durchgeführt werden. Die hier getesteten Überwachungsgeräte wurden in Schüttelkolben appliziert, könnten aber auch für größere Volumina wie Single-Use Bioreaktoren (S.U.B.) eingesetzt werden.

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