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Optische Biomasse-Messungen in einer Salvia fruticosa Zellkultur
Evaluierung des SFR vario für Pflanzenzellanwendungen
P. Scherhag1, G. T. John2, C. Haas3 und J.-U. Ackermann1
1Hochschule für Technik und Wirtschaft, Bereich Chemieingenieurwesen , Dresden, Deutschland
2PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Deutschland
3Technische Universität, Institut für Naturstofftechnik, Dresden, Deutschland
Die Suspensionskultur von Pflanzenzellen gewinnt bei der Herstellung von pharmazeutisch aktiven Substanzen zunehmend an Bedeutung, da sie von Umwelteinflüssen unabhängig ist. Um industrielle Produktionsprozesse zu etablieren, ist vor allem die Überwachung der Biomasseentwicklung über die Zeit besonders wichtig. Da Pflanzenzellen in Suspensionskultur zur Aggregation neigen, ist es schwierig, die optische Dichte (OD) zu überwachen. In diesen Experimenten wurden online Biomasse-Messungen - basierend auf Streulichtdetektion - mit dem SFR vario getestet. Die gesammelten Online-Daten von Salbei (Salvia fruticosa) Suspensionskulturen waren in guter Übereinstimmung mit offline, gravimetrisch gemessenen Biomassewerten. Darüber hinaus wurden mit dem SFR vario online Sauerstoffmessungen durchgeführt, die zusätzliche Informationen über den Stoffwechselstatus der Kulturen lieferten.
Die Verwendung von Pflanzenzellen in industriellen Produktionsprozessen erfordert, dass die Produktausbeute erhöht wird. Für ein erfolgreiches Scale-up ist detailliertes Wissen über Kulturleistung und Biomasseentwicklung erforderlich. Da Pflanzenzellen dazu neigen, in Suspensionskulturen große Aggregate zu bilden, ist die Messung der optischen Dichte (OD) kaum anwendbar. In dieser Studie wurden verschiedene Online- und Offline-Biomassemessverfahren getestet, um eine geeignete Überwachungsroutine für Produktionsprozesse mit Pflanzenzell-Suspensionskulturen zu finden. Das SFR vario Gerät wurde für online O2, OUR, pH und Biomasse Messungen in Schüttelkolben entwickelt. Sein Biomasse-Messprinzip basiert auf der Detektion von Streulicht. Von der Optik des Geräts emittiertes Licht wird von den Zellen im Kulturmedium reflektiert und mit einer Photodiode detektiert. Das SFR vario wurde zur Überwachung der Zellkultur von S. fruticosa Zellen verwendet. Diese Zellen bilden eine sehr feine Kultur, wobei keine Aggregate größer als 2 mm gebildet werden. Wir verglichen die Online-Biomassedaten, die mit dem SFR vario gemessen wurden, mit dem offline bestimmten Zelltrockengewicht und dem abgesetzten Zellvolumen. Da das SFR vario ein Multi-Parameter-Messsystem ist, wurde es zusätzlich dazu verwendet, Sauerstoff in der Pflanzenzell-Suspensionskultur während einer Batch-Kultivierung (12 Tage) zu überwachen, um weitere Informationen über den metabolischen Status der Zellen zu erhalten.
Material & Methoden
Suspensionskultur von Salbei (S. fruticosa) wurde in 250 ml Glasschüttelkolben mit einem Arbeitsvolumen von 50 ml durchgeführt. Die Kultur wurde in flüssiges Linsmaier-Skoog-Medium mit 30 g/l Saccharose als Kohlenstoffquelle und dem Phytohormon 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure inokuliert. Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 5,7 eingestellt. Das Inokulum betrug 20 % des Arbeitsvolumens. Eine Kultur wurde online mit dem SFR vario (PreSens GmbH, Deutschland) überwacht, und Sauerstoff und Biomasse gemessen. Um die Online-Messungen nicht zu stören, wurden mehrere Kulturen parallel durchgeführt und Offline-Proben wurden jeweils aus einem separaten Erlenmeyerkolben entnommen. Die Zellen wurden 12 Tage in einem abgedunkelten Schüttelinkubator bei 26 °C und 110 U/min kultiviert. Online-Messungen mit dem SFR vario wurden in 30-Minuten-Intervallen durchgeführt. Das Zelltrockengewicht und das abgesetzte Zellvolumen wurden in Offline-Messungen als Referenzen bestimmt. Für die Messung des abgesetzten Zellvolumens wurden 10 bis 15 ml Kultur aus einem Probenschüttelkolben in ein skaliertes 15 ml Röhrchen überführt und zur Sedimentation für 30 Minuten beiseite gestellt. Nachdem sich die Zellen am Boden des Röhrchens abgesetzt hatten, wurde das Zellvolumen als Prozentsatz des Gesamtvolumens abgelesen. Zur Bestimmung des Zelltrockengewichts wurden 15 ml Kultur auf einen trockenen und zuvor gewogenen Filter (5 μm Porengröße, Sartorius AG, Deutschland) gegeben und mit Nalgene® DS0320-5045 (Thermo Fisher Scientific, USA) vakuumiert. Der Filterkuchen wurde dann zweimal mit deionisiertem Wasser gewaschen und gefriergetrocknet. Danach wurde er gravimetrisch gewogen. Tests wurden in Duplikaten durchgeführt, um die Genauigkeit zu verbessern.
On- und Offline Biomasse-Messungen in Pflanzenzell-Suspensionskultur
Die Korrelation des Online-Biomassesignals und des offline bestimmten Zelltrockengewichtes, das in zwei Experimenten gesammelt wurde, zeigt eine lineare Anpassung, wie in Abb. 2 zu sehen ist. Variationen in den Offline-Daten wurden wahrscheinlich durch leicht abweichendes Wachstum in jeder Schüttelflasche und in Folge dessen unterschiedlicher Zellaggregation in jeder der Probenkulturen verursacht. Die Formel y = 0,1075 x + 0,12257 wurde verwendet, um die Biomasse-Signalamplitude, die mit dem SFR vario gemessen wurde, zu kalibrieren und sie in die Zelltrockengewichtskonzentration umzuwandeln. In Abbildung 3 sind die kalibrierten Online-Biomassewerte in g/l von zwei unabhängigen Experimenten zusammen mit den jeweiligen Offline-Messwerten für Zelltrockengewicht und abgesetztes Zellvolumen aufgetragen. Alle Messmethoden zeigen den gleichen Trend bei der Biomasseentwicklung. Die Online-Messungen zeigten lineares Wachstum nach einer kurzen exponentiellen Phase, die für Pflanzenzellen in Suspensionskultur typisch ist. Darüber hinaus zeigten diese Daten unterschiedliche Wachstumsmuster von S. fruticosa in den beiden Experimenten, mit einer längeren exponentiellen Phase in Experiment 2. Diese Variationen könnten auch durch unterschiedliche Anfangszelldichten und somit unterschiedliche Aggregation von Zellen in jeder Kultur verursacht worden sein. Dieser Befund konnte nicht aus den Offline-Daten abgeleitet werden und zeigt deutlich den Vorteil des Online-Messsystems. In den Online-Daten beider Experimente wurden maximale Biomassewerte nach ca. 200 h Kultivierungszeit erreicht. Offline-Daten zeigen verschiedene Punkte maximaler Biomasse bei 200 h für Experiment 2 und 250 h für Experiment 1. Wie zuvor erwähnt, wurden Proben für Offline-Messungen jeweils aus getrennten Kulturen entnommen, so dass nicht ganz synchronisiertes Wachstum in den verschiedenen Schüttelkolben diese Variationen verursacht haben könnte. Der im Schüttelkolben integrierte Sauerstoff Sensor Spot, der mit dem SFR vario ausgelesen wurde, lieferte ein sehr gutes Online-Signal im Vergleich zu den amperometrischen Sensoren, die zur Überwachung von Pflanzenzellkultur in Bioreaktoren eingesetzt werden und einen sehr hohen Rauschanteil aufweisen (Daten nicht gezeigt). Die Online-Sauerstoffmessungen zeigten für die ersten 100 h der Kultivierungsperiode einen konstanten Abfall des Sauerstoffgehalts und blieben während der Wachstumsphase bei einem Minimum von etwa 50 % O2-Sättigung, was auf eine hohe metabolische Aktivität der Zellen hinweist. Die leichten Schwankungen könnten auf metabolische Prozesse der Pflanzenzellen während der linearen Wachstumsphase hindeuten, die bisher nicht untersucht worden sind. Nach Erreichen der maximalen Biomasse stoppten die Zellen ihre metabolische Aktivität und der Sauerstoffsättigungsgrad im Kulturmedium begann wieder anzusteigen.
Zusammenfassung
Die Anwendbarkeit von Online-Messungen mit dem SFR vario zur Überwachung von Pflanzenzell-Suspensionskulturen wurde mit einer S. fruticosa Zellsuspensionskultur nachgewiesen. Die Online-Daten sind konsistent mit gravimetrisch bestimmten Offline-Werten und geben eine detailliertere Ansicht der Kulturleistung im Vergleich zu den Offline-Einzelpunktmessungen. In Kombination mit Online-Sauerstoffmonitoring konnten wertvolle Informationen über das Stoffwechselverhalten der Kulturen gewonnen werden. Weitere Tests mit anderen Pflanzenzelllinien, die größere Aggregate bilden, sind geplant, um das Online-Biomassemonitoring mit dem SFR vario in der Pflanzenzellkultur weiter zu evaluieren.