Optische pH-Überwachung in einem mikrofluidischen System für Zellkultur

In einem Testaufbau wurde die Kamera an eine starre Halterung aus rostfreiem Stahl montiert. Die Kamera war der Probe zugewandt, die an einem 3D-Mikromanipulator befestigt war, der unten am Fuß der Stahlhalterung festgeschraubt wurde (Abb. 1). Die Probe konnte somit leicht in der x-y- und z-Achse bewegt werden um sie auf die Kameraoptik auszurichten. Das gesamte System wurde in einer Box platziert, um Umgebungslicht während der Messungen abzuschirmen. Der fluidische Kanal bestand aus einer Silikongummidichtung, die zwischen einem Deckel aus transparentem Polymethylmethacrylat und einem Glasdeckglas eingeklemmt war. Die Sensorfolie wurde vor dem Anbringen der Dichtung auf den Glasträger geklebt und das Imaging wurde von unten durch das Glas hindurch durchgeführt. Ein typisches Bild, das mit dem VisiSens USB-Mikroskop aufgenommen wurde, ist in Abb. 2A zu sehen. Die Kontur der Dichtung ist auf dem Bild gut zu erkennen. Die scharfen Kanten, die typischerweise zu Beginn der Messungen zu sehen sind, werden mit der Zeit unschärfer, da Flüssigkeit die Sensorfolien durchtränkt und innerhalb der Sensorschicht diffundiert (Abb. 2B). Kalibrierungspuffer wurden aus Natriumdihydrogenphosphatdihydrat und Dinatriumhydrogenphosphatdihydrat hergestellt und auf fünf verschiedene pH-Werte eingestellt. Die Beispielbilder in Abb. 2C - D wurden erzeugt, indem der Kanal zuerst mit dem sauersten Puffer gefüllt und dann der basische Puffer auf der rechten Seite des Kanals hinzugefügt wurde.

Die ratiometrische Bildanalyse ist eine effiziente Methode, um einen schnellen Eindruck von Gradienten oder Hotspots innerhalb des Kanals zu erhalten. Ein Beispiel ist in 2C - D zu sehen, wo das Mischen einer sauren (pH = 4,5) und einer basischen (pH = 8,5) Flüssigkeit in der zentralen Region des Kanals sichtbar gemacht wurde. Trotzdem ist es oft notwendig, das Signal in bestimmte pH-Werte zu übersetzen. Die Kalibrierung wird durchgeführt, indem der Kanal nacheinander mit Puffern mit bekannten pH-Werten gefüllt wird, und jeweils ein Bild aufgenommen wird nachdem die Folie mit der neuen Lösung äquilibriert wurde. Es wird eine nichtlineare Kalibrierungskurve erstellt, mit der die berechneten Relationen als pH-Werte interpretiert werden können. Vier mögliche Interferenzen müssen besonders berücksichtigt werden, um eine genaue Kalibriermessung zu erhalten: Folienäquilibrierzeit, Pufferkontamination, kolorimetrische Interferenz und progressive Schwächung des Signals im Laufe der Zeit aufgrund von Photobleichung. Wenn die Äquilibrierung unvollständig ist, könnte das Signal durch die vorherige Pufferfüllung gestört sein. Unsere Tests zeigten, dass man zwischen dem Einfüllen der Flüssigkeit in den Kanal und dem Erfassen des Bildes für die Kalibrierung mindestens 8 Minuten warten sollte, aber jeder Benutzer sollte selbst ein paar anfängliche Messungen vornehmen, um die optimalen Parameter für seinen Messaufbau herauszufinden. Das Spülen zwischen Pufferfüllungen, vorzugsweise mit dem nächsten zu messenden Puffer, vermeidet eine Kontamination von einem Puffer zum nächsten. Abb. 3 zeigt unsere Ergebnisse bei der Kalibrierung mit und ohne Spülung. Es gibt eine deutliche Verzögerung im Signal von einer Messung zur nächsten, wenn der Kanal nicht gespült wird, während in der gespülten Version das Signal nicht von der Abfolge abhängt, in der die Puffer gemessen werden. Wir empfehlen daher, zwischen den Kalibrierungspunkten zu spülen, um die Genauigkeit der Kalibrierung zu verbessern. Darüber hinaus können kolorimetrische pH-Indikatoren wie Phenolrot das Signal der pH-Sensorfolie stören. Solche Substanzen werden routinemäßig zu Vollzellkulturmedien als eine schnelle Überwachungsmethode für den Gesundheitszustand der Kultur hinzugefügt. Wir haben eine große Verschiebung des Sensorsignals beobachtet, als wir die Kalibrierung in Puffern mit und ohne Phenolrot durchgeführt haben (Abb. 4). Dies zeigt deutlich, wie wichtig es ist, mit Phenolrot-freiem Medium zu arbeiten, wenn Messungen mit den pH-Sensorfolien durchgeführt werden. Auch das Photobleichen des Fluoreszenzsensorfarbstoffs ist ein Faktor, der bei der Verwendung des Sensors über längere Zeiträume nicht vernachlässigt werden sollte. Länger andauernde Beleuchtung kann im Laufe der Zeit eine Signalverschiebung verursachen. Für Hochpräzisionsmessungen empfehlen wir daher die Folien nicht wiederzuverwenden. Eine zweite Kalibrierung nach Langzeitmessungen sollte durchgeführt werden. Auf diese Weise kann abgeschätzt werden, wie die Signaldrift die Messungen beeinflusst haben könnte.

Die VisiSens™ pH Sensorfolie ist eine effiziente Methode zur schnellen qualitativen Analyse von pH-Gradienten, wie in Abb. 2 C - D zu sehen ist. Für die quantitative pH-Messung innerhalb von  Fluidsystemen in kleinstem Maßstab müssen jedoch die oben genannten Punkte berücksichtigt werden. Es ist klar, dass eine genaue pH-Bestimmung über die Folie eine sorgfältig geplante Kalibrierungssequenz sowohl vor als auch nach den Experimenten erfordert. Auf der anderen Seite wird eine zu lange Kalibrierungsprozedur zu einer Signalschwächung aufgrund von Photobleichung beitragen, so dass das richtige Gleichgewicht gefunden werden muss.