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pH-Überwachung in Molkerei-Starterkulturen

Charakterisierung der Säureproduktion mit optischen Sensoren in Mikrotiterplatten

G. T. John1, D. Goelling2, I. Klimant3, H. Schneider2, und E. Heinzle1
1Technische Biochemie, Universität des Saarlandes, Saarbrücken, Deutschland
2Danisco Cultor Niebüll GmbH, Niebüll, Deutschland
3Institut für Analytische Chemie, Chemo- and Biosensoren, Universität Regensburg, Regensburg, Deutschland

Starterkulturen werden verwendet, um eine gute und reproduzierbare Qualität von Milchprodukten zu gewährleisten. In dieser Studie wurde eine einfach anzuwendende Methode entwickelt, um eine große Anzahl von Impfkulturen als Qualitätskontrolle für Rohmaterialien zu screenen. Mikrotiterplatten mit integrierten chemisch-optischen pH Sensoren wurden auf ihre Eignung zur Überwachung der Säureproduktion während der Milchgärung getestet. Unterschiede in Inokulum-Typ und in der Größe der Kulturen von Lactococcus lactis und Streptococcus thermophilus konnten eindeutig nachgewiesen werden, obwohl es Störungen gab, die durch im Medium enthaltene Partikel und Fluorophore verursacht wurden. Der neue Ansatz wurde mit dem etablierten CINAC-System verglichen. Diese frühe Studie führte zur Entwicklung einer verbesserten Sensorplatte - der HydroPlate.

Das Monitoring und Screening von Starterkulturen ist in der modernen Molkereitechnologie von großer Bedeutung, um die Qualität von Produkten wie z. B. Joghurt, Käse oder Buttermilch zu gewährleisten. Während der Milchfermentation werden organische Säuren, hauptsächlich Milchsäure, durch Mikroorganismen produziert, die den pH-Wert senken. Diese Säureproduktion kann zur Charakterisierung der Milchfermentation verwendet werden und ist daher eine wichtige Methode, um die Aktivität von Starterkulturen zu testen. Ziel dieser Studie war es, eine neue Methode zu entwickeln, mit der eine große Anzahl von Proben in Mikrotiterplatten durch optische pH-Messung gescreent werden kann. Vorversuche hatten gezeigt, dass die optischen Eigenschaften der Platten und insbesondere der Milch Einfluss auf das pH-Sensorsignal hatten, da die Sensoren nicht optisch isoliert waren. Die Ergebnisse der folgenden Fermentationsexperimente in Mikrotiterplatten mit integrierten pH Sensoren wurden mit der etablierten CINAC-Methode verglichen, um die Eignung dieses neuen Ansatzes zu überprüfen. Das CINAC-System ist sehr zuverlässig, jedoch auf 16 parallele Experimente beschränkt und sehr arbeitsintensiv aufgrund der erforderlichen Reinigung und Rekalibrierung der Elektrode. Die Mikrotiterplatten mit Sensoren sollten diese Nachteile beseitigen.

Material & Methoden

Für Messungen mit chemisch-optischen pH Sensoren wurden 10 µl einer Lösung, die pH-empfindliche und pH-unempfindliche Fluorophore enthielt, in jede Vertiefung einer 96-Well Polystyrolplatte mit rundem Boden (Greiner, Deutschland) getropft. Die resultierende Schichtdicke des so erzeugten Sensors betrug etwa 5 μm. Die Fluoreszenzintensität der pH-empfindlichen Indikatorfluorophore wurde durch Verwendung eines Anregungsfilters mit maximaler Transmission bei 492 nm gemessen. Die emittierte Fluoreszenz wurde nach Passieren eines Filters mit einem Transmissionsmaximum von 538 nm gemessen. Für die pH-unempfindlichen Referenzfluorophore wurde eine Kombination von 544 nm / 590 nm-Filtern verwendet. Str. thermophilus und Lc. lactis (Danisco, Deutschland) wurden für Milchfermentationsexperimente verwendet. Sie wurden gefriergetrocknet geliefert und bei - 20 °C gelagert. Aliquote von Kulturen (0,5 g, 0,1 g, 0,02 g) beider Stämme wurden jeweils zu 100 ml sterilisierter Phosphatpufferlösung gegeben. 1,2 ml dieser Inokula wurden in 200 ml Milchmedium (ultrahocherhitzte, homogenisierte Milch, 0,3 % Fett, Mibell, Deutschland) gegeben. Messungen wurden bei 30 ± 0,1 °C und 37 ± 0,1 °C durchgeführt. Jedes Experiment mit den optischen Sensoren wurde 8-fach in einem Fluoreszenzleser (BMG Fluostar, BMG Labtechnologies, Deutschland) durchgeführt. Für jede Messung wurden 200 μl Flüssigkeit pro Vertiefung verwendet. Der pH-Wert in der Mikrotiterplatte wurde ebenfalls mit einem pH-Meter (Mettler Toledo MP220, Mettler Toledo, Schweiz) und einer pH-Mini-Elektrode (Mettler Toledo Inlab® 423, Mettler Toledo, Schweiz) gemessen. Vergleichsexperimente wurden mit dem CINAC-System (Ysebaert, Frepillon, Frankreich) durchgeführt. Das System verwendet 16 pH-Elektroden. Für diese Messungen wurden 200 ml Glasflaschen vollständig mit Medium gefüllt, so dass keine Gasphase zurückblieb. Sie wurden während des gesamten Experiments geschlossen gehalten. Um erste Kalibrierkurven zu erhalten, wurden Kalibrierlösungen verwendet, die 90 % Milch enthielten. Die Lösungen wurden durch Mischen von 18 ml Milch mit 2 ml Lösungen von HCl und NaOH in verschiedenen Konzentrationen hergestellt. Messungen wurden alle 10 Minuten für 24 Stunden durchgeführt.

Eigenschaften der Milchfermentation

Abbildung 1 zeigt eine Kalibrierkurve des Sensormaterials. Unter Verwendung von Milch und Einstellen des pH-Werts mit Säure oder Base unterschied sich die resultierende Kurve signifikant von der Kalibrierkurve mit Pufferlösung von identischer Ionenstärke. Auf diese Weise konnten Störungen, die durch die optischen Eigenschaften von Milch verursacht wurden, überprüft werden. Vergleichsmessungen mit dem CINAC-System wurden unter Sauerstoffausschluss durchgeführt und die Messgefäße wurden nicht bewegt. In den Mikrotiterplatten war die Milch ständig Umgebungsluft ausgesetzt und die Platten wurden im Fluoreszenzleser bewegt. Daher wurden zusätzliche Offline-Messungen in den Platten mit einer pH-Elektrode durchgeführt. Für Experimente mit den pH- Mikrotiterplatten wurden die gefriergetrockneten Inokula von Str. thermophilus und Lc. Lactis bei 30 °C und 37 °C in sterilisierter Milch kultiviert. Aus den gemessenen Werten von Irel wurde der pH unter Verwendung einer der zwei Kalibrierungskurven, die in Abbildung 1 gezeigt sind, berechnet. Die Kalibrierung mit Milch konnte nur für pH-Werte über 5 entsprechend Irel > 0,56 verwendet werden (Abb. 2 oben). Für die ersten 3 bis 4 Stunden der Fermentation waren pH-Werte, die auf diese Weise berechnet wurden, ziemlich nahe an Werten, die mit der pH-Elektrode offline gemessen wurden. Die Ergebnisse des CINAC-Systems tendierten ähnlich wie die pH-Elektrodenmessung in den Mikrotiterplatten und zeigten, dass die Lufteinwirkung und die Bewegung der Platten keinen Einfluss auf den Fermentationsprozess hatten. Unter Verwendung der Pufferkalibrierkurve konnte eine pH-Abschätzung über die gesamten Messungen durchgeführt werden, wie in dem unteren Diagramm in Abbildung 2 dargestellt ist. Anfänglich waren die optisch geschätzten Werte beträchtlich höher als die Elektrodenwerte, stimmten jedoch zwischen 4 bis 10 Stunden Fermentationszeit ziemlich gut überein. Die Referenzmessungen mit dem CINAC-System waren ähnlich dem der optischen online Sensoren, und auch die Unterschiede zwischen den Inokulumgrößen und Kulturen zeigten ähnliche Zeitverläufe. Mit dem CINAC-System konnten jedoch keine Mindestwerte wie bei der optischen Messung festgestellt werden. Die Fermentation, die bei 37 °C, aber ansonsten identischen Bedingungen durchgeführt wurde, ergab ähnliche Ergebnisse wie für 30 °C. Die langsamer wachsende Str. thermophilus Kultur zeigte andere Kurvenverläufe (Ergebnisse nicht gezeigt). Die Ergebnisse zeigen, dass die Fermentationsleistung verschiedener Inokulumkulturen unter Verwendung der pH-Messplatten verglichen werden konnte.

Zusammenfassung

Mikrotiterplatten mit integrierten chemisch-optischen Sensoren (Optoden) ermöglichen die parallele Messung von 96 Kulturen. Trotz einiger Störungen während der Fermentation konnte das erhaltene Signal verwendet werden, um zwischen Starterkulturen mit unterschiedlicher Aktivität zu unterscheiden. Auch Stämme mit unterschiedlichen Fermentationseigenschaften, wie Lc. lactis und Str. thermophilus, zeigten unterschiedliche Formen des pH-Sensorsignals Irel. Die Hauptvorteile dieses neuen Systems im Vergleich zu etablierten Methoden sind seine Einfachheit, die große Anzahl von Proben, die parallel mit den Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen gemessen werden können, und die immense Reduzierung des Arbeitsaufwandes. Mikrotiterplatten mit integrierten chemisch-optischen Sensoren sind eine vielversprechende Methode für Tests und Forschungsanwendungen, bei denen eine große Anzahl von Proben untersucht werden muss. Heute wird für diese und ähnliche Anwendungen eine verbesserte pH-Sensorplatte (HydroPlate) mit optischer Isolierung und geringerer Querempfindlichkeit gegenüber Milchbestandteilen verwendet.

Applikationsbericht nach
John et al., 2003, pH-Sensing 96-well microtitre plates for the characterization of acid production by dairy starter cultures, J Dairy Res. 70 (3), pp. 327 - 333

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