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Sauerstoffgradienten in Kollagen-I-Gelen
Bestimmung von Sauerstoffgradienten in Kollagen-I-Gelen für das Tissue Engineering mit faseroptischen Profiling Mikrosensoren und einem automatischen Mikromanipulator
Laura Heimann1, Paul Wolff1, Elizabeth Rosado Balmayor1, Martijn van Griensven1, Gregor Liebsch2, Robert Meier2, Martin Gutbrod2
1Experimentelle Unfallchirurgie, Technische Universität München (TUM), München, Deutschland
2PreSens GmbH, Regensburg, Deutschland
Kollagen-I-Gele, die mit aus Fettgewebe gewonnenen mesenchymalen Stammzellen beladen waren, wurden mit dem automatisierten Profilingsystem von PreSens (Automated Micromanipulator AM und Profiling O2 Microsensor PM) auf Sauerstoffgradienten untersucht. Das System kann im Inkubator verwendet werden und erlaubt räumlich hochaufgelöste Messungen bis zu 10 μm. In dieser Studie wurden Kontrollgele ohne Zellen mit Gelen verglichen, die mit zwei verschiedenen Zelldichten beladen waren. Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass Sauerstoffwerte vom Zellgehalt und der Zellmenge abhingen. Unbeladene Gele zeigten im Gegensatz zu Gelen, die Zellen enthielten, durchgehend hohe Sauerstoffkonzentrationen. Je mehr Zellen ein Gel enthielt, desto tiefer sankt der innere Sauerstoff-Partialdruck, wahrscheinlich aufgrund eines höheren Verbrauchs.
Im Falle von verzögerter Heilung oder schlecht heilender Brüche langer Knochen (10 - 40 % aller Fälle) wird ein Ansatz gesucht, um die Knochenheilung zu beschleunigen. Das Tissue Engineering bietet hier eine Möglichkeit, bestehend aus einem Gerüst (Matrix), Zellen und stimulierenden Faktoren. Ein limitierender Aspekt dabei ist die kurze Diffusionsstrecke von Sauerstoff von etwa 200 μm. Ohne Sauerstoff würde das gesamte Konstrukt absterben, daher ist es enorm wichtig, die Sauerstoffversorgung in situ beobachten zu können. PreSens hat mehrere Messsysteme entwickelt, die auf einem Fluoreszenzlöschverfahren basieren, das selbst keinen Sauerstoff verbraucht und am Messpunkt kein elektrisches Potential erzeugt. In den hier beschriebenen Experimenten wurde ein automatisiertes Profilingsystem verwendet, um Sauerstoffgradienten zu ermitteln, die sich in zellbesiedelten Gerüsten bilden. Der Automated Micromanipulator hält einen optischen Sauerstoffmikrosensor, der aus einer Quarzglasfaser hergestellt ist (Abb. 1). Dieses System ermöglicht eine sehr präzise und vibrationsfreie Positionierung des Sensors, mit einer Auflösung von bis zu 10 μm entlang der z-Achse, wodurch wir genaue Sauerstoffgradienten-Daten in verschiedenen Gerüstmaterialien ermitteln können.
Material & Methoden
Bevor mit dem Messvorgang begonnen wird, muss der Sauerstoffsensor mit Natriumsulfitlösung (0% Sauerstoff) und luftgesättigtem destilliertem Wasser (100% Luftsättigung) kalibriert werden. Kollagen-I-Gele wurden mit 10-fach konzentriertem DMEM, destilliertem Wasser und 3 verschiedenen Mengen an Zellen (keine Zellen, niedrige und hohe Zelldichte) vorbereitet. Die Gelierung war nach 2 Stunden Inkubation beendet, woraufhin Medium auf die Gele gegeben wurde. Die Microx 4-Messeinheit wurde im Inkubator installiert und von außen mit einem Laptop gesteuert. Der Sensor wurde an der Grenze zwischen Luft und Medium positioniert und in 100 μm-Schritten auf den Boden der Well-Platte zubewegt. Die PreSens Profiling Studio Software ermöglichte die Einstellung von variablen Schrittweiten, Messgeschwindigkeiten und Wartezeiten.
5-wöchige AdMSC in vitro Kultivierung in Kollagen-I-Gelen
Gele wurden für 5 Wochen kultiviert und jede Woche bewertet. Abbildung 2 und 3 zeigen, dass ab dem Tag 0 ein offensichtlicher Sauerstoffgradient und ein Unterschied zwischen den 3 Ausgangs-Bedingungen beobachtet werden konnte. Das Kontroll-Gel ohne Zellen blieb bei Plateau-Werten von 19 % O2. Gele mit niedriger Zelldichte zeigten durchweg höhere Sauerstoffkonzentrationen als Gele mit mehr Zellen. Darüber hinaus nahmen die Sauerstoffkonzentrationen mit jeder Woche ab, beginnend bei etwa 18 % O2 unmittelbar nach der Gelierung, 17% O2 nach 3 Tagen in vitro, 16,5 % O2 nach 7 - 28 Tagen in vitro bis sie einen Plateau-Wert von 16 % O2 erreichten.
Zusammenfassung
Das automatisierte Profilingsystem ist in der Lage, kleinste Sauerstoff-Mikrogradienten in Kollagen-I-Konstrukten zu detektieren. Mit dieser wertvollen Information ist es möglich zu bestimmen, welcher Sauerstoff-Partialdruck in welcher Tiefe eines Hydrogels auftritt. Im Bereich des Tissue Engineering könnte dies ein sehr nützliches Werkzeug sein, um z. B. die Sauerstoffversorgung von zellbeladenen Konstrukten zu beobachten, die Patienten implantiert werden sollen.