Überwachung von CO₂, Sauerstoff und Biomasse in E. coli Schüttelkolbenkulturen

CO₂ ist ein wichtiger Parameter in mikrobiellen Kulturen, da es Wachstum unter bestimmten Bedingungen hemmen oder stimulieren kann. In diesem Experiment, in dem E. coli-Dauxie online überwacht wurde, konzentrierten wir uns insbesondere auf die Messwerte von gelöstem CO₂ und Sauerstoff. Mit dem SFR vario von PreSens können Sauerstoff, pH-Wert und Biomasse in einem Erlenmeyerkolben optisch gemessen werden. Darüber hinaus kann OUR automatisch mit der Reader-Software berechnet werden. Wir haben einen optischen CO₂ Sensor Spot (SP-CD1, PreSens), der mit dem SFR vario ausgelesen wurde, hinsichtlich seiner Eignung zur Online-Überwachung von mikrobiellen Kulturen getestet. Dafür wurde der Sensor Spot wie der Sauerstoffsensor in den Schüttelkolben integriert und mit der üblicherweise zur online pH-Überwachung verwendeten Readeroptik ausgelesen. Das Messsystem erlaubt solche benutzerspezifischen Anpassungen und ermöglicht die Online-Überwachung mehrerer Parameter gleichzeitig. Neben der Online-Messung von Biomasse, Sauerstoff und dCO₂ haben wir auch offline den pH-Wert, die Substratkonzentrationen und OD₄₂₀ bestimmt. Durch die Messung mehrerer Parameter – die alle diesselben Entwicklungen zeigten - wurde die Messsicherheit erhöht.

E. coli MG1655 wurde in einem chemisch definierten Medium nach Evans [1] kultiviert, mit 0,15 % Glukose und 1 % Glyzerin als einzige Kohlenstoffquellen. Das Medium wurde mit Phosphatpuffer auf pH 7 gepuffert. Zur Kultivierung wurden 500 ml Schüttelkolben aus Kunststoff mit Septum und einem Arbeitsvolumen von 200 ml verwendet. Die Erlenmeyerkolben wurden mit einem O₂ Sensor Spot (SP-PSt3, PreSens) ausgestattet und zusätzlich wurde ein CO₂ Sensor Spot (SP-CD1, PreSens) mit einem Integrationssystem (IS-SP, Abb. 1) am Kolbenboden angebracht. Beide Sensoren wurden mit dem SFR vario durch den Kolbenboden ausgelesen, während das Lesegerät mittels Streulichtmessung auch Biomasse detektierte (Abb. 2). Der CO₂ Sensor wurde in der Position angebracht, in der normalerweise ein pH Sensor in den Sensorkolben integriert ist. Auf diese Weise konnte die Leseroptik für die pH-Überwachung zum Auslesen des optischen Kohlendioxidsensors verwendet werden. Die Kultivierung wurde bei 37 °C und 200 U/min inkubiert. Online-Messungen mit dem SFR vario wurden durch Offline-Überwachung des pH-Werts, der Glukose- und Glyzerinkonzentration und der Bestimmung von OD₄₂₀ unterstützt.

Die Grafik (Abb. 3) zeigt den erwarteten, charakteristischen Verlauf des zweiphasischen E. coli-Wachstums. In der ersten Wachstumsphase (etwa 1 bis 4 Stunden) wird Glukose als Kohlenstoffquelle verwendet, während Glyzerin nicht metabolisiert wird. Die Biomasse steigt in dieser Phase, während Sauerstoff verbraucht und CO₂ produziert wird. Der Sauerstoffverbrauch gekoppelt mit der simultanen CO₂-Produktion zeigt die aerobe Metabolisierung von Glukose. Nach ca. 4,5 h steigt der gelöste Sauerstoffgehalt wieder vorübergehend an, während gelöstes CO₂ abnimmt. In dieser Phase wird das bevorzugte Substrat Glukose vollständig verbraucht und die Zellen treten in eine kurze Lag-Phase ein. Nach ein paar Minuten gehen die Mikroorganismen dazu über Glyzerin zu verstoffwechseln und wachsen weiter. Gelöster Sauerstoff nimmt mit zunehmender Zellzahl ab und fällt während dieser zweiten Wachstumsphase auf Null. Dies zeigt sich auch in einem langsameren Anstieg der online Biomasse- und offline OD-Messwerte. Aufgrund der Sauerstofflimitierung können E. coli-Zellen nicht mehr mit maximaler Wachstumsrate auf Glyzerin wachsen. Das verlangsamte Wachstum ist in der Steigung der dCO₂-Kurve deutlich zu erkennen. Nach etwa 10 Stunden ist das Glyzerin verbraucht und die Kultur tritt in die stationäre Phase ein. Ohne Substratverbrauch steigt der gelöste Sauerstoffgehalt wieder auf 100 %, während CO₂ langsam abnimmt. In diesem Experiment ist es schwierig, die Wachstumsrate basierend auf dem online Biomassesignal und den OD-Werten zu bestimmen. Die zusätzlich gemessenen CO₂-Werte lassen jedoch nach einer anfänglichen schnellen Wachstumsphase auf Glyzerin ein verlangsamtes Wachstum erkennen. Es wurde erwartet, dass die gelöste CO₂-Konzentration am Ende der Kultivierungsperiode auf Null sinken würde, jedoch konnte nur ein langsamer Rückgang auf etwa 1,8 % CO₂ festgestellt werden. Dies könnte durch Zelllyse und den Verbrauch einiger Zellbestandteile durch die übrigen Zellen verursacht worden sein, so dass noch etwas CO₂ während dieser Restaktivität produziert wurde.

Die Evaluierung des CO₂ Sensors für das online Monitoring in mikrobiellen Kulturen zeigte schlüssige Ergebnisse, die der erwarteten Entwicklung von gelöstem CO₂ während des zweiphasigen Wachstums entsprachen und die Aktivitätsniveaus der Zellen sehr gut zeigten. In Kombination mit den Sauerstoffmessungen konnten die CO₂-Messwerte verifiziert werden, da die Messwerte beider Parameter entsprechende Tendenzen zeigten. Die gleichzeitige Online-Überwachung mehrerer Parameter mit dem SFR vario erhöhte die Messsicherheit, da alle Aufzeichnungen die gleichen Merkmale aufwiesen, was eine genauere Beurteilung des aktuellen Kulturstatus ermöglichte. Vorteilhaft ist auch, dass das SFR vario System einfach an die spezifischen Benutzeranforderungen angepasst und das Auslesen des CO₂ Sensors anstelle eines pH Sensors durch sehr einfache Anpassungen realisiert werden kann. Das Online-Monitoringgerät bietet ein sicheres und zeitsparendes Messinstrument für die Kulturüberwachung in Schüttelkolben.

Referenzen
[1] Evans et al. (1970), Chapter XIII, The Continuous Cultivation of Micro-organisms 2, Construction of a Chemostat, Meth Microbiol 2: 277 - 327