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Untersuchung der ATP-Synthese über oxidative Phosphorylierung in C. glutamicum

Messungen des Sauerstoffverbrauchs einer ATP-Synthase-Deletionsmutante und des Wildtyp-Stammes mit dem SFR Shake Flask Reader

A. Koch-Koerfges1, A. Kabus1, I. Ochrombel2, K. Marin2, und M. Bott1
1Institut für Bio- und Geowissenschaften (IBG-1), Forschungszentrum Jülich, Deutschland
2Institut für Biochemie, Universität zu Köln, Deutschland

Wir charakterisierten und untersuchten Wachstum, Nebenproduktbildung und Bioenergetik einer F1F0-ATP-Synthase-Deletionsmutante von C. glutamicum. Die Mutante wuchs nicht mit Acetat als einziger Kohlenstoffquelle, erreichte aber 47 % der Wachstumsrate und 65 % der Biomasse des Wildtyps, wenn sie in Schüttelkolben mit Glukose als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle kultiviert wurde. Gelöster Sauerstoff (DO) in der Kultur wurde online und nicht-invasiv mit dem SFR Shake Flask Reader überwacht, der es ermöglichte, den Sauerstoffverbrauch von Wildtyp- und Mutantenstamm mit Analyseergebnissen anderer Parameter zu vergleichen. Die SFR-Messung zeigte den Grund für eine biphasische Glukoseaufnahmerate der Mutante: Wenn Sauerstoff limitierend wurde, war die Glukoseverbrauchsrate der Mutante geringer als die des Wildtyps. Die Ergebnisse zeigen, dass die F1F0-ATP-Synthase und die oxidative Phosphorylierung im Allgemeinen für das Wachstum von C. glutamicum auf Substraten, die eine Phosphorylierung auf Substratebene erlauben, nicht essentiell sind.

C. glutamicum ist der wichtigste Mikroorganismus für die groß angelegte biotechnologische Herstellung von L-Glutamat und L-Lysin, und dient auch als Modellorganismus für verschiedene Pathogene, z.B. für Mycobactericum tuberculosis, mit dem es eng verwandt ist. Daher wird der Stoffwechsel dieses Bakteriums intensiv untersucht. Die meisten aeroben, atmenden Bakterien gewinnen ATP sowohl durch Phosphorylierung auf Substratebene (SLP) als auch durch oxidative Phosphorylierung oder allgemeiner durch Elektronentransportphosphorylierung (ETP). In dieser Studie wurde die Rolle der ATP-Synthese durch ETP in C. glutamicum näher untersucht. In ETP synthetisiert der Mikroorganismus ATP mit der membrangebundenen F1F0-ATP-Synthase und nutzt Protonengradienten als treibende Kraft. Obwohl allgemein angenommen wird, dass C. glutamicum ATP hauptsächlich über ETP synthetisiert, wurden bisher kaum Tests an der F1F0-ATP-Synthase durchgeführt. In dieser Studie wurde daher eine definierte ΔF1F0-Mutante des C. glutamicum Stammes ATCC 13032 analysiert, der alle Gene, die für die F1F0-ATP-Synthase kodieren, fehlten. Die Stämme wurden in Schüttelkolben mit integrierten chemisch-optischen Sensoren kultiviert, und der gelöste Sauerstoffgehalt wurde nicht-invasiv und online mit dem SFR Shake Flask Reader von PreSens aufgezeichnet. Auf diese Weise konnte der Sauerstoffverbrauch in Kulturen der Mutante und des Wildtyps über die gesamte Kultivierungszeit gemessen und später mit Analyseergebnissen anderer Parameter verglichen werden.

Material & Methoden

C. glutamicum Stämme und Plasmide, die in dieser Arbeit verwendet wurden, sowie Vorkulturbedingungen sind in [1] aufgelistet und beschrieben. Hauptkultivierungen wurden in 500 ml Glasschüttelkolben mit Schikanen und einem Septum zur sterilen Probennahme durchgeführt, mit 50 ml Glukose-Minimalmedium bei 30 °C und 130 U/min. Der Sauerstoffverbrauch wurde mit dem SFR Shake Flask Reader (PreSens) basierend auf nicht-invasiven Messungen mit autoklavierbaren chemisch-optischen Sensoren bestimmt. Diese Sensoren sind in den Schüttelkolben integriert (Abb. 1) und werden durch die transparente Kolbenwand mit dem im Schüttler installierten SFR ausgelesen. DO in % Luftsättigung wurde in einem Intervall von 10 min während der Kultivierungszeit gemessen. Methoden zur Bestimmung von Wachstumsrate, Biomassekonzentration und Glukose sowie organischen Säuren sind ausführlich in [1] beschrieben. Spezifische Glukoseaufnahmeraten (sGUR) wurden unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet:

sGUR (ti,ti+1) = ((cglc,i - cglc,i+1)/(ti+1 - ti)) x

(2 / (XCDW,i+1 + XCDW,i))  [gGlukose/gDW h]

dabei ist cglc die Glukosekonzentration (gl-1), XCDW das Zelltrockengewicht (CDW) pro Volumen (gl-1) und (ti + 1 - ti) das untersuchte Zeitintervall (h).

Ergebnisse

Anfängliche Tests auf Agarplatten, die CGXII-Minimalmedium mit entweder 222 mM Glukose oder 100 mM Acetat als einzige Kohlenstoffquelle enthielten, wurden durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass die Mutante in der Lage war, mit Glukose zu wachsen, wenn auch viel langsamer als der Wildtyp. Mit Acetat als einziger Kohlenstoffquelle gab es kein Wachstum. Im Gegensatz zu Glukose erlaubt der Acetat-Katabolismus in einer ATP-Synthase-Mutante keine Synthese von NET-ATP über SLP. In einer Schüttelkolbenkultur unter Verwendung von CGXII-Minimalmedium mit 4 % (w / v) Glukose als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle konnte die ΔF1F0-Mutante mit 47 % der Wachstumsrate des Wildtyps wachsen (0,19 ± 0,02 h-1 gegeüber 0,40 ± 0,01 h-1) und erreichte 65 % der Biomasse des Wildtyps (10,3 ± 0,5 g(CDW) l-1 gegenüber 15,8 ± 3 g(CDW) l-1), wie in Abb. 2 A dargestellt ist.  Diese Ergebnisse zeigen, dass die F1F0-ATP-Synthase für das Wachstum von C. glutamicum auf Substraten, die eine Netto-ATP-Synthese über SLP erlauben, nicht zwingend erforderlich ist. Die Wildtyp-Kultur nahm kontinuierlich Glukose auf, bis diese nach 24 Stunden vollständig verbraucht war (Abb. 2 B). Die Kinetik der ΔF1F0-Mutante zeigte dagegen zwei unterschiedliche Phasen, mit einer Veränderung nach 5 - 11 h, und der Glukoseverbrauch war nach 30 h beendet. Innerhalb der ersten Stunden der Kultivierung erreichte der berechnete sGUR der Mutante Werte von ≥ 328 ± 72 nmol min-1 (mg CDW)-1, die dreifach höher sind als beim Wildtyp mit sGUR ≥ 89 ± 1 nmol min-1 (mg CDW)-1. In der zweiten Phase lagen die sGUR-Werte der Mutante im Bereich von 21 ± 16 nmol min-1 (mg CDW)-1, also viel niedriger als im Wildtyp. Um eine Erklärung für die biphasische Glukoseaufnahme der Mutante zu finden, wurde der Sauerstoffverbrauch durch optische Messung von gelöstem Sauerstoff (DO) mit dem SFR gemessen. Anfänglich verbrauchte die ΔF1F0-Mutante Sauerstoff schneller als der Wildtyp (Abb. 3 A), während sie eine niedrigere Wachstumsrate zeigte, was auf eine viel höhere Atmungsrate der Mutante hindeutet. Die DO-Konzentration in der Mutantenkultur erreichte nach 7 - 8 h Nullwert. Sauerstoffmangel korrelierte mit der Abnahme der Glukoseaufnahme. So verursachte die Verfügbarkeit des terminalen Elektronenakzeptor-Sauerstoffs die zwei verschiedenen Phasen im Glukose-Katabolismus der Mutanten. Der erhöhte Glukoseverbrauch wurde von Beginn der Kultivierung an begleitet von Pyruvat-Ausscheidung ins Medium (Abb. 3 B), während keine anderen organischen Säuren nachgewiesen werden konnten. Nach 8 Stunden, als Sauerstoff limitierend und die Glukoseaufnahmerate reduziert wurde, wurde Pyruvat erneut verbraucht. Im Gegensatz zu der ΔF1F0-Mutante sezernierte der Wildtyp kein Pyruvat.

Zusammenfassung

Untersuchungen an einer Mutante von C. glutamicum, bei der die ATP-Synthese durch oxidative Phosphorylierung fehlte, zeigten, dass sie auf Substraten wie Glukose, die SLP ermöglicht, wachsen konnte. Dies beweist, dass die F1F0-ATP-Synthase im Allgemeinen für diesen Organismus nicht essentiell ist. Der Glucose-Katabolismus der Mutante zeigte zwei unterschiedliche Phasen, abhängig von der Verfügbarkeit des endgültigen Elektronenakzeptors Sauerstoff. Die Durchführung einer nicht-invasiven Online-Überwachung von DO mit dem SFR machte es leicht, den Kohlenstoffquellenverbrauch mit der Sauerstoffaufnahme der Mutante und des Wildtyps zu vergleichen. Das SFR erwies sich als ein einfaches und zeitsparendes Werkzeug, das wichtige Einblicke in den Metabolismus dieses Mutantenstammes ermöglichte.

Applikationsbericht nach
[1] A. Koch-Koerfges et al., 2012, Physiology and global gene expression of a Corynebacterium glutamicum ΔF1F0-ATP synthase mutant devoid of oxidative phosphorylation, Biochimica et Biophysica Acta 1817, pp. 370 - 380

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