Zweischichtige Hydrogele auf Alginat-Basis mit eingebetteten Zellen für die regenerative Therapie osteo-chondraler Defekte

Verwendung von O₂ Nadelmikrosensoren zur Messung der Sauerstoffsättigung in einem künstlichen Knorpelkonstrukt

Für die Translation eines Tissue Engineering-Ansatzes auf klinische Anwendungen ist die Zellvitalität für die Regeneration von Gewebeschädigungen von entscheidender Bedeutung. Einblick in den gesamten und lokalen Status von adhärenten oder eingebetteten Zellen, insbesondere im Zentrum von Zell-Matrix-Konstrukten, ist essentiell für die Optimierung, Zellvitalität und Differenzierung. Die Überwachung der Sauerstoffkonzentrationen zeigt den Zustand der Zellen innerhalb der Konstrukte, und ist daher wichtig für die Entwicklung von geeigneten Zellträgermatrizen, Scaffolds genannt. Im Falle von Knorpel werden hypoxische Bedingungen bevorzugt. Daher wurde der Einfluss von eingebetteten Chondrozyten und sauerstoffsequestrierenden Molekülen auf den Sauerstoffgehalt in Alginat-basierten Gerüsten untersucht. Eine Verringerung der Sauerstoffsättigung auf ungefähr 80 % wurde beobachtet. Die Sauerstoffmikrosensoren in Nadelbauweise erwiesen sich als sehr effektiv, um den Sauerstoff innerhalb eines Hydrogels unter sterilen Bedingungen zu überwachen.

Die Kontrolle des Sauerstoffgehalts von Zell-Matrix-Konstrukten spielt eine sehr wichtige Rolle in der regenerativen Therapie und im Tissue Engineering. Knorpel ist ein hypoxisches Gewebe mit geringer Regenerationsfähigkeit. Daher ist es wichtig, vitale und homogen verteilte Zellen in das Konstrukt einzubringen und ihre Position für eine erfolgreiche Heilung aufrecht zu erhalten. Biphasische aber monolithische Gerüste können als vielversprechender Ansatz zur Behandlung osteo-chondraler Defekte, bei denen Knorpel und darunterliegender Knochen geschädigt sind, eingesetzt werden [1]. Die Verankerung des Konstrukts im Knochen wird durch eine Schicht gewährleistet, die die keramische Phase von Knochen beinhaltet. Chondrozyten werden in Alginat-Hydrogel eingebettet, das Komponenten der Knorpelmatrix [2] enthält und Sauerstoff-steuernde Funktionalisierung besitzt. Ziel der Studie war es, die durch lebende Chondrozyten und die chemische Modifikation verursachte Reduktion der Sauerstoffsättigung innerhalb der Chondralschicht des Scaffolds unter sterilen Bedingungen nachzuweisen und vorzugsweise zu quantifizieren.

Material & Methoden

Carboxylgruppen von Alginat wurden mit Molekülen funktionalisiert, um ein konstruiertes System zu schaffen, das die Sauerstoffperfusion in azellularisierten und mit Zellen besiedelten Tissue Engineering Scaffolds kontrolliert. Biphasische aber monolithische Bio-Hybrid-Gerüste mit parallel ausgerichteten Porenkanälen wurden mittels ionotroper Gelierung [1] unter sterilen Bedingungen erzeugt. Dafür wurde ein Alginat-basiertes Sol mit Hydroxyapatit, Solen von reinem Alignat oder einem Gemisch mit dem modifizierten Alginat in einen Becher gegeben und über Nacht mit Calciumionen geliert. Die Phase ohne keramische Partikel sollte der Reparatur des Knorpels dienen, daher wurden  Chondrozyten in einem zweiten Versuchsdurchlauf in diese Schicht eingebettet. Das Hydrogel wurde geschnitten und in eine zylindrische Form gestanzt. Nadel-Mikrosensoren (PreSens, Regensburg, Deutschland) sind Glasfasern mit einer sauerstoffempfindlichen Beschichtung, die in eine Spritze mit Stahlnadel eingebaut sind, was das Einstechen in weiche Materialien erlaubt. Der experimentelle Aufbau ermöglichte die Verwendung des nadelartigen Mikrosensors in einem Standard-Zellkulturinkubator (1A + B). Für die in vitro Anwendung wurden die Nadeln und Glasfaserspitzen mit 70 % Ethanol desinfiziert. Die Nadeln wurden innerhalb des chondralen Teils der Gerüste positioniert (Abb. 1 C). Gerüste mit oder ohne Zellen wurden in Dulbeccos minimal essentiellem Medium (DMEM) in einer Platte mit 24 Vertiefungen kultiviert. Eingebettete lebensfähige Chondrozyten wurden unter Verwendung des MTT-Assays gefärbt (Fig. 2). Die Änderung der Sauerstoffsättigung wurde über 3 Tage in einem Inkubator gemessen und auf die Messung ohne Zellen oder Modifikation normalisiert (3). Zwei Experimente mit jeweils 3 Proben (mit unterschiedlichem Gehalt an modifiziertem Alginat) wurden durchgeführt; das erste mit zellfreien Gerüsten und das zweite mit Gerüsten einschließlich eingebetteter Chondrozyten. Es wurde jedoch nur eine Messung pro Konzentration durchgeführt (n = 1), um das Prinzip zu beweisen.