kLa Messung in TubeSpin Bioreaktoren

TubeSpin Bioreaktoren werden als kostengünstige Alternative zu großformatigen Kultivierungssystemen für Zellkultur eingesetzt. Die Eigenschaften der Kultivierungsröhrchen hinsichtlich des Sauerstofftransfers sind jedoch kaum untersucht worden. Mit einem speziell angepassten SFR Shake Flask Reader und chemisch optischen Sensoren mit schneller Reaktionszeit von PreSens wurde der k_La für TubeSpin-Systeme ermittelt. Die Eigenschaften dieser Kultivierungsgefäße wurden genauer untersucht. Sauerstoffüberwachung in TubeSpin Bioreaktoren ist ein wichtiger Schritt hin zu definierten Screening-Prozessen.

TubeSpin Bioreaktoren werden zur Zellkultivierung im ml-Maßstab in orbital geschüttelten Inkubatoren eingesetzt. Die Entwicklung optimierter Zellkulturmedien und die Identifizierung spezifischer Zelllinien können somit schnell und kostengünstig durchgeführt werden [1]. In der Literatur gibt es zur Zeit wenig Informationen über den Sauerstofftransfer in TubeSpin Bioreaktoren. Zhang [2] untersuchte die Eigenschaften von TubeSpin Bioreaktoren und listete k_La-Werte bis 29 h^-1 auf. Der volumetrische Sauerstoff-Massentransferkoeffizient (k_La) gibt die Fähigkeit des Sauerstofftransfers von der Gasphase in die flüssige Phase an [3].

Der SFR Shake Flask Reader

Der PreSens SFR Shake Flask Reader ist seit 2009 im Handel erhältlich. Er ermöglicht die Messung von gelöstem Sauerstoff (DO) in Schüttelkolben mit integrierten Einwegsensoren, die von einer speziellen Leseeinheit im Shaker ausgelesen werden. Die aufgezeichneten Daten werden kabellos über eine Bluetooth-Verbindung an einen PC übertragen. PreSens hat dieses System weiterentwickelt und erweitert, sodass es mit TubeSpin Bioreaktoren verwendet werden kann. Die Erweiterungen bestehen aus speziellen Adaptern um die Röhrchen in Position zu halten und die DO-Werten über die integrierten Single-Use Sensor Spots (Abb. 1) auszulesen. DO-Messungen in TubeSpin Bioreaktoren können zur Überwachung des Sauerstoffverbrauchs der Zellen bei Screening Prozessen eingesetzt werden. Darüber hinaus ist es nun möglich, TubeSpin Bioreaktoren durch Messung der k_La-Werte genauer zu charakterisieren.

Optische Sauerstoffmessung

DO-Messungen werden mit chemisch-optischen Sensoren durchgeführt, die am Boden der Bioreaktoren angebracht sind (Abb. 1). Ein großer Vorteil gegenüber herkömmlichen Sauerstoffsonden (z. B. Clark-Elektroden) ist die minimale Größe der Sensorspots. Die Integration größerer konventioneller Sauerstoffsonden würde das Strömungsverhalten der Flüssigkeit in den TubeSpin Bioreaktoren verändern. Darüber hinaus sind TubeSpin Bioreaktoren für konventionelle Sonden zu klein, und aufgrund der orbitalen Schüttelbewegung ist Flüssigkeit nicht immer in Kontakt mit der Sonde. Ein weiterer Vorteil der Sensor Spots ist ihre Ansprechzeit von 10 - 30 s, die die herkömmlicher Sauerstoffsensoren übertrifft. Im Jahr 2002 wurden solche Spots bereits zur Bestimmung von k_La in Schüttelkolben verwendet und es konnten verlässliche Werte von bis zu 150 h^-1 gemessen werden.

Die Sauerstofftransferrate (OTR) wurde bei 25 °C in einer koaleszenzreduzierten wässrigen Lösung (0,2 M Na₂SO₄) unter Verwendung der dynamischen Sulfitmethode [4] gemessen. Wenn Co²⁺ vorhanden ist, reagiert Sulfit zu Sulfat, das Sauerstoff verbraucht (chemische Oxidation), bis DO den 0%-Wert erreicht (Sauerstoffverarmung). Ab diesem Zeitpunkt wird DO bei definierten Parametern (Füllvolumen, Frequenz, Amplitude) in Intervallen von 10 s aufgezeichnet, bis eine Sättigung von 95 % erreicht ist. Die k_La-Werte werden aus dem gemessenen DO durch Linearisierung der Reaktion in einem Bereich von 20 % bis 80 % der Sättigungskonzentration berechnet (die Sauerstoffsättigung wird durch Diffusion aus der Umgebungsluft unter Verwendung von ventilierten Kappen realisiert). k_La in TubeSpin Bioreaktoren wurde in Triplets mit variierenden Volumina (10 - 30 ml) und Schüttelfrequenzen (150 - 300 U/min) gemessen. Darüber hinaus wurden Amplituden von 25 und 50 mm untersucht, die bei Laborschüttlern üblich sind. Ein statistischer Versuchsplan (DoE) wurde verwendet, um die Anzahl der Experimente zu bestimmen und Daten auszuwerten.

Ergebnisse

In den TubeSpin Bioreaktoren wurden k_La-Werte in einem Bereich von 0,5 h^-1 ± 30 % bis 21 h^-1 ± 10 % bestimmt (Tab. 1). In Einweg-Schüttelkolben wurden k_La-Werte von bis zu 10⁴ h^-1 ermittelt. Nach Auswertung der Daten wurde die folgende Korrelation von Füllvolumen (FS), Frequenz (FR) und Amplitude (AM) in TubeSpin Bioreaktoren mit der Statistiksoftware Visual XSel 11.0 identifiziert:

k_La = (1.196007 + 4.089 x 10^-3 x FR - 80,2998 x FS - 0.04206 x AM + 0.166267 x FR x FS + 2.53 x 10^-4 x FR x AM + 0.633247 x FS x AM)²

Diese Korrelation kann in einem dreidimensionalen Oberflächendiagramm dargestellt werden (Abb. 2). Die höchsten k_La-Werte wurden mit einer Amplitude von 50 mm erreicht. Interessanterweise zeigten Experimente, dass hohe Füllvolumina mit einer Amplitudeneinstellung von 50 mm und einer hohen Schüttelfrequenz (> 250 U/min) zu hohen k_La-Werten in den TubeSpin Bioreaktoren führten. Dieses Verhalten kann durch einen vergrößerten Flüssigkeits-Luft-Oberflächenbereich und einen größeren Bereich, in dem die Flüssigkeit in Kontakt mit der Gefäßwand ist, verursacht werden, was durch die zylindrische Form der Röhren unterstützt wird. Die Flüssigkeit rotiert als dünner Film entlang der Gefäßwand, was den Gasmassentransfer in die Flüssigkeit erhöhen kann (Abb. 3). In Schüttelkolben kann ein solcher Effekt nicht beobachtet werden, da eine Fluidrotation aufgrund der konischen Form der Gefäße nur im unteren Teil des Bioreaktors möglich ist [5]. Diese Effekte können derzeit vom statistischen Modell nicht vorhergesagt werden weswegen weitere Tests notwendig sind. Mit einem k_La-Wert von 21 h^-1 können CHO-Zellen mit einer spezifischen Sauerstoffverbrauchsrate von 9 x 10^-12 g (Zelle h)^-1 gezüchtet werden, um unter nicht einschränkenden Bedinungen Zelldichten von mehr als 56 x 10⁶ Zellen ml^-1 zu erreichen.

Zusammenfassung

Mit dem SFR Shake Flask Reader können Messungen schneller und effizienter durchgeführt werden als mit herkömmlichen invasiven Sonden. Die relativ freie Wahl der Messfrequenzen und die schnelle Reaktionszeit der Einwegsensoren ermöglichen eine stabile DO-Messung. Mit den miniaturisierten Sensor Spots können Kulturbedingungen auch in kleinen, einfachen Bioreaktoren wie TubeSpin-Systemen überwacht und angepasst werden. Mit dem SFR sind in diesen "Black-Box" Bioreaktoren Sauerstofftransferuntersuchungen möglich. Dies ist ein wichtiger Schritt in Richtung definierter Screening-Prozesse. Unter Verwendung dieses Systems wurde eine statistische Korrelation von Bewegungsparametern und dem spezifischen Sauerstoff-Massentransferkoeffizienten k_La in TubeSpin Bioreaktoren ermittelt.

Referenzen
[1] Tsai, et al.: Noninvasive Optical Sensor Technology in Shake Flasks, BioProcess International, Vol. 10, No. 1 (2012), 50 - 56
[2] Zhang, et al.: Efficient oxygen transfer by surface aeration in shaken cylindrical containers for mammalian cell cultivation at volumetric scales up to 1000 L, Biochem Eng J 45 (2009), 41 - 47
[3] Schumpe, et al.: Gas Solubilities in Microbial Culture Media, (2008) 1 - 38
[4] Garcia-Ochoa, et al.: Bioreactor scale-up and oxygen transfer rate in microbial processes: An overview, Biotechnolgy Advances 27 (2009), 153 - 176
[5] Maier, et al.: Advances in understanding and modeling the gas-liquid mass transfer in shake flasks, Biochem Eng J 17 (2004), 155 - 167