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Auswirkung einer Pseudomonas-Infektion auf den Stauerstoffstatus von Arabidopsis-Blättern
Visualisierung der Sauerstoffdynamik in Pflanzengewebe
Jagadis Gupta Kapuganti
Biochemistry & Systems Biology, Department of Plant Sciences, University of Oxford, GB
Um die Verbreitung von Krankheitserregern zu verhindern, verwenden infizierte Pflanzen eine Art von Zelltod - die sogenannte hypersensitive Reaktion. In dieser Studie wurde das weit verbreitete Modellsystem von Arabidopsis und Pseudomonas zur Untersuchung von Pflanzen-Pathogen-Interaktionen und Krankheitsentwicklung verwendet. Das VisiSens™ Sauerstoff-Bildgebungssystem wurde zur genaueren Untersuchung der Sauerstoffverteilung in infizierten Blättern, die eine hypersensitive Reaktion durchliefen, angewendet. Die Ergebnisse zeigten, dass sich die Sauerstoffkonzentrationen nicht änderten, wenn Pflanzen mit Kontrollmedium behandelt wurden, während die Sauerstoffkonzentrationen in Blättern, die mit Pseudomonas syringae infiziert waren, nach sechs Stunden abzunehmen begannen. Innerhalb von 24 Stunden erreichten diese Blätter einen Sauerstoffgehalt von 50 %.
Die hypersensitive Reaktion (HR) ist eine Form des Zelltods. Es ist ein Mechanismus, den Pflanzen nutzen, um die Ausbreitung von Krankheitserregern zu verhindern. Eine der Eigenschaften von HR ist der schnelle Zelltod, der in der infizierten Region des Wirts stattfindet, um eine weitere Ausbreitung des Pathogens zu verhindern. Pathogene sezernieren avirulente Genprodukte, die von avr-Genen kodiert werden. Diese avr-Genprodukte interagieren mit Pflanzenresistenz-Genprodukten (R-Genen) und diese Interaktion führt zur Entwicklung von HR. Zellen, die HR durchlaufen, produzieren verschiedene freie Radikale wie Wasserstoffperoxid (H2O2), Superoxid (O2-), Stickoxid (NO), Peroxynitrit (ONOO-) und viele Zwischenprodukte freier Radikale. Diese Verbindungen sind an der Signalgebung während der HR beteiligt. Sauerstoff ist lebenswichtig für die Pflanzenatmung, er fungiert als terminaler Elektronenakzeptor in der mitochondrialen Elektronentransportkette der Pflanze. Sauerstoffproduktion und -konsum finden in den grünen Blättern statt. Sauerstoffgehalt und Atmung spielen eine Rolle bei der Produktion verschiedener freier Radikale und bei der metabolischen Reprogrammierung von Pflanzen. Arabidopsis und Pseudomonas ist ein weit verbreitetes Modellsystem zur Untersuchung der Pflanzen-Pathogen-Interaktion und der Krankheitsentwicklung. Bisher wurde in diesem Modell viel Forschung betrieben, um Pflanzen-Pathogen-Interaktionen zu verstehen, aber es ist fast nichts ist über die Sauerstoffverteilung in infizierten Blättern bekannt, die HR durchlaufen. Diese Information ist sehr wichtig für das Verständnis von Pflanzenkrankheiten und Resistenzmechanismen. Der virulente Stamm P. syringae pv. Tomate DC3000 avr (Pst) produziert Toxine, die Chlorose und Läsionen im infizierten Wirtsgewebe induzieren. In dieser Studie haben wir das Sauerstoff-Bildgebungssystem VisiSens™ verwendet, um die Sauerstoffverteilung in infizierten Blättern über längere Zeiträume zu überwachen. Die optische Sensorfolie wurde an der Blattoberfläche befestigt und mit der Detektoreinheit ausgelesen. Die aufgenommenen Bilder wurden verwendet, um Sauerstoffveränderungen in den infizierten Blättern zu quantifizieren.
Material & Methoden
Eine sauerstoffempfindliche Sensorfolie (SF-RPSU4, PreSens) wurde auf die untersuchten Blätter gelegt und mit der USB-betriebenen Detektoreinheit (VisiSens™, PreSens) ausgelesen. Die Zweipunktkalibrierung der Sensorfolie wurde durchgeführt, indem ein Tropfen frisch hergestellten Natriumdithionats (Na2S2O4) in die Mitte der Sensorfolie gegeben und ein Bild aufgenommen wurde, das zur spätere Berechnung der Sauerstoffkonzentrationen mit der VisiSens AnalytiCal 1 Software diente. Nach dem Aufzeichnen des Kalibrierwertes wurde die Sensorfolie zuerst durch Abwischen mit 70 % Ethanol sterilisiert und mehrmals mit autoklaviertem, doppelt destilliertem Wasser abgewischt. Sobald die Sensorfolie getrocknet war, wurde sie auf das Blatt gelegt. Ein Tropfen Wasser wurde auf das Blatt gegeben, um den direkten Kontakt der Probenoberfläche mit der Sensorfolie zu ermöglichen. Pseudomonas syringae pv. DC3000-Bakterien wurden über Nacht in KB-Medium gezüchtet, dann bei 3.000 g für 5 Minuten bei 4 °C zentrifugiert und dreimal mit 10 mM MgCl2 gewaschen. Sie wurden in MgCl2 resuspendiert und die optische Dichte bei 600 nm gemessen. Die Bakterien wurden in 10 mM MgCl2 auf 0,005 verdünnt und dann in die Abaxialseite des Blattes infiltriert. Nach der Infiltration wurde die Sensorfolie auf das Blatt gelegt und der Sauerstoffgehalt aufgezeichnet. Sauerstoff wurde nach 0, 2, 4, 6, 16 und 24 Stunden gemessen.
Sauerstoffniveaus in infizierten Blättern
Es ist sehr wichtig, die Sauerstoffdynamik in Pflanzengeweben, die einem pathogenen Angriff ausgesetzt sind, zu kennen. Der Sensor gab Informationen über die Sauerstoffverteilung und -dynamik während des Infektionsprozesses. Es war möglich, quantifizierte Sauerstoffwerte zu erhalten, die für die Interpretation der Daten wichtig sind. Blätter, die mit avirulenten Krankheitserregern infizierte sind, durchlaufen verschiedenen Veränderungen. Die Erkennung eines Erregers oder pathogener Auslöser führen zu oxidativen Schüben und zur Bildung verschiedener freier Radikale. Um ROS in pathogeninfizierten Pflanzen vollständig zu verstehen, sind Sauerstoffveränderungen ein Schlüsselfaktor. Zum Beispiel induziert Hypoxie die Stickoxidproduktion. Das produzierte NO reagiert wiederum mit Superoxid und bildet Peroxinitrit (ONOO-), welches eine sehr wichtige Verbindung ist, die den Zelltod induziert. In diesen Experimenten fanden wir heraus, dass sich die Sauerstoffniveaus nicht veränderten, wenn Blätter mit 10 mM MgCl2 als Kontrolle behandelt wurden (3). In mit Pseudomonas infizierten Blättern begann der Sauerstoffgehalt ab der sechsten Stunde abzunehmen (Abb. 2). Nach 16 Stunden fiel die Sauerstoffkonzentration auf 70 % und erreichte nach 24 Stunden 50 % (Abb. 4). Die Abnahme des Sauerstoffgehalts zu späteren Zeitpunkten während der Infektion kann mehrere Gründe haben: Eine mögliche Erklärung besteht darin, dass die hypersensitive Reaktion viele Prozesse mit dem Alterungsprozess teilt. Mitochondrien können sich in späteren Stadien dieser Entwicklung auflösen. Ein anderer möglicher Grund ist, dass Bakterien Sauerstoff verbrauchen und sich schnell entwickeln, während sie mit den Blättern um Sauerstoff konkurrieren. Drittens ist die Photosynthese des grünen Blattes betroffen, was zu einer geringeren Sauerstoffproduktion führt.
Zusammenfassung
Mit dem VisiSens™ Sauerstoffbildgebungssystem konnten Sauerstoffverteilungen und -dynamiken an infizierten Pflanzenblättern bestimmt werden. Die Experimente lieferten erste Einblicke in zeitliche Veränderungen der Sauerstoffverteilung während der Krankheitsentwicklung. Weitere Experimente unter Verwendung verschiedener virulenter und avirulenter Pathogene und die Messung von Sauerstoff in verschiedenen transgenen Pflanzen, die mit verschiedenen Pathogenen infiziert sind, werden sehr wertvolle Informationen über biochemische Ereignisse während Pflanzen-Pathogen-Interaktionen liefern.