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Evaluierung des SDR SensorDish® Readers für die Anwendung in der Bakterienstamm-Entwicklung
Überwachung verschiedener E. coli-Stämme in Deep Well OxoDishes®
Olaf Christensen
Lonza Ltd., Visp, Schweiz
Wir haben mehrere Tests durchgeführt, um die Anwendbarkeit des SDR SensorDish® Readers in Kombination mit Deep Well OxoDishes® in der Stammentwicklung zu evaluieren. Wir haben den Sauerstoffverbrauch von induzierten und nicht-induzierten E. coli-Stämmen mit dem SDR gemessen und Medien-Tests durchgeführt, bei denen das Substrat in Kulturen, die unterschiedliche Proteine produzieren, variiert wurde. Sauerstoffmessungen, die in parallelen Experimenten aufgezeichnet wurden, zeigten eine ausgezeichnete Reproduzierbarkeit und ermöglichten uns außerdem, jederzeit detaillierte Informationen über den Stoffwechselstatus der Kulturen zu erhalten. Im Vergleich zu Standard-Endpunktanalysen bietet dieses Echtzeit-Monitoring-System neue Möglichkeiten, z. B. bei der Entwicklung von Erntestrategien und der Optimierung von Medien.
Sauerstoff ist ein wichtiger Parameter in der Mikroben- und Zellkultur. Die Überwachung von O2 während des Produktionsprozesses hilft, Fehler aufgrund von Sauerstofflimitierung zu vermeiden und liefert wertvolle Informationen über den Stoffwechselstatus der Kulturen. Der Einsatz von Multiwell-Platten mit integrierten Sauerstoffsensoren am Boden jedes Wells - wie die OxoDishes® von PreSens - ist sehr interessant für Stammentwicklungsstudien, da paralleles Online-Monitoring mehrerer Stämme in einem Versuchsdurchlauf gemacht werden kann. Die Deep Well-Version der OxoDishes® ermöglicht das Schütteln der Kulturen. Ein Duetz-Klemmsystem und eine Metallabdeckungen wurden verwendet, um den SDR SensorDish® Reader mit der Deep Well-Platte im Shaker zu befestigen. Wir haben getestet, ob dieses System für Studien zur Stammentwicklung geeignet ist und ob die Online-Sauerstoffmessungen zur Identifizierung vielversprechender Stämme beitragen können.
E. coli Kultur in Deep Well OxoDishes®
Drei verschiedene E. coli-Stämme - die alle das gleiche Protein produzieren - wurden in einem Deep Well OxoDish® mit einem Volumen von 2 ml/Well bei 30 °C und 280 Upm (d = 50 mm) kultiviert. Alle drei Stämme wurden induziert; zusätzlich wurde Sauerstoff in dem nicht induzierten Stamm A und in reinem Medium (Kontrolle) gemessen (Abb. 1). Die abnehmenden Sauerstoffwerte während der ersten 8 h zeigen das exponentielle Wachstum und die hohe metabolische Aktivität aller Stämme. In der nächsten Phase hörte das Wachstum auf und der Sauerstofftransfer in das Medium entsprach dem Sauerstoffverbrauch der Bakterien, was sich in stabilen Sauerstoffwerten von etwa 14 % O2 für die nächsten 8 Stunden zeigte. Dann setzte die Substratlimitierung ein und die Sauerstoffwerte begannen aufgrund eingestellter metabolischer Aktivität und Zelltod wieder anzusteigen. Ein kleines Plateau in den Sauerstoffkurven nach 15 Stunden Kultivierung zeigt an, dass eine metabolische Umstellung stattgefunden hat und die E. coli-Kulturen auf die Metabolisierung eines anderen Substrats umgestiegen sind. Nach 1,5 h war dieses Substrat ebenfalls verbraucht und die Sauerstoffwerte stiegen auf Luftsättigung an. Eine Ausnahme bildet der induzierte Stamm A, der während der Experimente ein ungewöhnliches Verhalten zeigte. Durch sein verlangsamtes Wachstum kam es erst sehr viel später zu Substratbeschränkungen als in den anderen Kulturen. Eine Erklärung dafür könnten die extrem hohen Produktionsraten des Stamms A sein, so dass die Bakterien womöglich durch das Endprodukt gestresst waren.
Medientests mit dem SDR
Für Medientests wurde der induzierte oder nicht induzierte E. coli Stamm C, der entweder Protein 1 (= PRO1, Abb. 2) oder Protein 2 (= PRO2, Abb. 3) produzierte, in Deep Well OxoDishes® unter den gleichen Bedingungen wie oben erwähnt kultiviert. Die OxoDishes® wurden dabei entweder mit einer Folienmembran abgedeckt (um Verdunstung zu vermeiden) oder mit der Metallabdeckung des Klemmsystems versehen. Verschiedene Medienzusammensetzungen wurden verwendet, um die Kulturleistung und die Produktion zu bewerten, wenn Substrate variiert werden. Wir benutzten halb-definiertes Medium (MM) (Lonza AG, Schweiz), Medium mit halber oder doppelter Menge Hefeextrakt (1/2 oder 2 x YE), halber oder doppelter Menge Ammonium (1/2 oder 2 x NH4Cl) und der doppelten Menge Hefeextrakt und Glycerin (2 x YE + Gly). Sauerstoffmessungen über einen Zeitraum von 24 Stunden zeigten, dass unabhängig vom Produkt die Daten von E. coli in den verschiedenen Medien sehr gut vergleichbar sind. Während Kulturen mit der doppelten Menge an YE das schnellste Wachstum zeigten, wurde das Substrat auch am schnellsten verbraucht. Die doppelte Menge an YE + Gly zeigte ebenfalls ein schnelles Wachstum, aber die zusätzliche C-Quelle Glycerin verlängerte die Aktivitätsphase der Kultur. Die doppelte oder halbe Menge an NH4Cl schien das Wachstum nicht zu beeinflussen, da die Kulturen in beiden Medien die gleiche metabolische Aktivität aufwiesen, so dass NH4Cl als nicht limitierend eingestuft werden kann. Kulturen mit der halben Menge an YE wuchsen am langsamsten und erreichten eine Substratlimitierung erst nach mehr als 20 Stunden. Diese Ergebnisse zeigen, je mehr YE zum Medium gegeben wird, desto schneller wachsen die E. coli-Kulturen unabhängig vom Produkt. Glycerin kann verwendet werden, um die Aktivitätsphase zu verlängern. Beim Vergleich nicht induzierter und induzierter Kulturen zeigen die Sauerstoffmessungen, dass nur die induzierte PRO1-produzierende Kultur in MM langsamer wächst und eine längere Aktivitätsphase aufweist als die nicht induzierte Kultur. Bei PRO2-produzierenden E. coli weisen die induzierten Kulturen längere Aktivitätsphasen auf, die eine Einschränkung erst später als die nicht induzierten Kulturen erfahren. Dies könnte auf eine metabolische Verschiebung und den anschließenden Verbrauch eines anderen Substrats zurückzuführen sein. OD- und Expressionsanalysen (Abb. 4) stimmten gut mit den Online-Messungen überein. Hier zeigten Kulturen in 2 × YE auch stärkstes Wachstum, während diejenigen in 1/2 YE am wenigsten gewachsen waren, und sowohl Medien mit unterschiedlichen NH4Cl-Konzentrationen als auch Kulturen in Minimalmedium erzeugten ähnliche OD. Die Verwendung von Standard-Folienabdeckungen im Vergleich zu den Metallabdeckungen hatte keinen Einfluss auf die Produktivität, und es gab keinen Unterschied in der PRO1-Expression unter Verwendung einer Standard Deep Well-Platte und dem Deep Well OxoDish ® (Daten nicht gezeigt).
Zusammenfassung
Der SDR SensorDish® Reader in Kombination mit den Deep Well OxoDishes® ist einfach aufzubauen und liefert Sauerstoffmessungen mit hervorragender Reproduzierbarkeit. Wir konnten die Kulturleistung verschiedener Stämme vergleichen und zeigen, dass Medientests mit dem SDR durchgeführt werden können, wobei man verschiedene Komponenten in einem Versuchsdurchlauf vergleichen kann. Insgesamt bietet dieses System einen großen Vorteil gegenüber den gängigen Endpunktanalysen.
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