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Sauerstoff- und pH-Effekte von Modulatorwirkstoffen auf SK-MEL-Zellkulturen

PhoxyCube ermöglicht Multiwell-Doppelanalyt-Überwachung

Sandra Friedrich1, Barbara Goricnik1, Robert Johannes Meier2, Joachim Wegener1
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Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik, Universität Regensburg, Regensburg, Deutschland
2 PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Deutschland

Die Überwachung der Sauerstoff- und pH-Werte ist in Zellkultur von entscheidender Bedeutung, insbesondere für SK-MEL-Zellen, eine menschliche Melanom-Zelllinie, die in dieser Studie verwendet wurde. Sauerstoff ist für die Zellatmung und die Energieproduktion unerlässlich, während der pH-Wert die Enzymaktivität, den zellulären Stoffwechsel und die allgemeine Lebensfähigkeit beeinflusst. Abweichungen in O2 oder pH können zu metabolischem Stress, verändertem Zellverhalten und ungenauen Versuchsergebnissen führen. Bei SK-MEL 28-Zellen, die empfindlich auf Veränderungen der Mikroumgebung reagieren, ist die Aufrechterhaltung optimaler Bedingungen entscheidend für ein gleichmäßiges Wachstum, die Lebensfähigkeit und die genaue Untersuchung krebsbezogener Prozesse wie Metastasierung und Arzneimittelwirkung.

Dieser Anwendungsbericht beschreibt die gleichzeitige Online-Aufzeichnung von Sauerstoff- und pH-Werten in adhärenten SK-Mel-Zellkulturen unter Verwendung des PreSens PhoxyCube. Der PhoxyCube ist ein variables Multiwell-Sensor-Lesegerät, das gelösten Sauerstoff und / oder pH in mehreren Wells verschiedener Well-Plattenformate während Kultivierung im Inkubator messen kann. Die optischen O2- und pH-Sensoren werden auf nicht-invasive Weise durch den Boden der Platten ausgelesen. Die Messung ermöglicht die Visualisierung der Zellproliferationskinetik und die Untersuchung der Auswirkungen von Stoffwechselmanipulationen in der Zellkultur in Echtzeit.

Material & Methoden

O2- und pH-Änderungen während der Kultur wurden mit dem PhoxyCube Gerät (PreSens, Regensburg, Deutschland) mit einer 24-Well-Platte mit O2- und pH-Sensoren in jedem einzelnen Well (PhoxyPlate 24 OP, siehe Abb. 1 B) aufgezeichnet. Die PhoxyPlates wurden in 95 % luftgesättigtem Medium (gemessener pH-Wert von 7,6) bei 37 °C im Inkubator (5 % CO2) für mindestens 3 Stunden eingeweicht und voräquillibriert. Nach der Voräquilibrierungsphase wurde mit der PreSens PhoxyCube Reader Software eine Ein-Punkt-Anpassung für O2 (bei 95 % a.s.) und für pH (bei pH 7,6) durchgeführt. Alle Wells der Plattenspalten 2 bis 6 wurden mit SK-MEL 28-Zellen in Phenolrot-freiem DMEM-Wachstumsmedium (Gibco) + Glucose (500 µL mit 4,5 g/L Glucose) mit einer Aussaatdichte von 300 T/cm² beimpft. Spalte 1 der 24-Well-Platte enthielt nur Wachstumsmedium ohne Zellen als Blindkontrolle. Nach 24 Stunden wurde das Medium in allen Vertiefungen gegen frisches Wachstumsmedium ausgetauscht.

Abb. 2: A) Aufbau des Versuchs. Spalte 1: L15-Glucose (Blank ohne Zellen), Spalte 2: SK-MEL in L15-Glucose, Spalte 3: SK-MEL in L15 - keine Glucose, Spalte 4: SK-MEL L15-Glucose mit Antimycin A als Atmungsblocker, Spalte 5: SK-MEL in L15-Glucose mit Malonoben als Entkopplungsmittel und Spalte 6: SK-MEL in L15-Glucose mit einem Pestizid (Acetamiprid) als Testsubstanz. Die Gruppen für O2 und pH mit N=4 wurden mit der PhoxyCube Reader Software ausgewählt. B) Gemessene O2- und pH-Kinetik während der Wachstums- und Versuchsphasen. Phase 1*: Zellaussaat und Anheftung in Zellkultur-Wachstumsmedien mit Glukose für 24 h, Phase 2**: Medienaustausch mit frischem Zellkultur-Wachstumsmedium mit Glukose für 24 h, Phase 3***: Experimentphase.

48 Stunden nach der ersten Zellaussaat wurde das Wachstumsmedium mit Leibovitz's L15-Medium ohne Phenolrot (Gibco, kurz L15), L15-Glucose (ohne Zellen) in Spalte 1, L15-Glucose in Spalte 2, L15 ohne Glucose in Spalte 3, L15-Glucose mit Antimycin A als Atmungsblocker in Spalte 4, L15-Glucose mit Malonobene als Entkopplungsmittel in Spalte 5 und L15-Glucose mit einem Pestizid (1 mM Acetamiprid, 4,45 % (v/v)) als unbekannte Prüfsubstanz in Spalte 6 ausgetauscht. Die Zelladhäsions- und Wachstumsphase wurde mit einem Messintervall von 20 min aufgezeichnet, die Versuchsphase (beginnend mit dem Medien-/Substrataustausch nach 48 Stunden) mit einem Intervall von 5 min.

Ergebnisse

Während der Anheftungs- und Wachstumsphase verhalten sich alle zellhaltigen Proben hinsichtlich des O2-Verbrauchs und der pH-Veränderung gleich (siehe Abb. 2). Die Blindprobe bleibt konstant bei einem pH-Wert von 7,6 und 95 % a.s. Nach der Anheftung und dem Wachstum der Zellen für 48 Stunden findet der eigentliche Versuch statt. Alle Testreihen (mit jeweils n = 4 Experimenten) beginnen bei etwa 70 % a.s. und pH 6,6 nach Zugabe von Medien und Testsubstanz. Der Blindversuch ohne Zellen ergibt einen konstanten pH-Wert von 7,0 und einen konstanten pO2-Wert von etwa 100 % Luftsättigung (rote Kurven). Die Luftsättigung ist höher als in der vorangegangenen Anheftungsphase, da das CO2 (5% v/v) im Inkubator ausgeschaltet wurde. SK-MEL-Zellen in regulärem L15-Medium mit Glukosezusatz (grüne Kurven) zeigen einen leichten und stetigen pH-Abfall über 12 Stunden. Die entsprechende O2-Kurve zeigt einen Abfall auf 50 % a.s. nach 1 Stunde und beginnt dann langsam anzusteigen, was auf das Eindringen von Sauerstoff zurückzuführen ist. Zellen in glukosefreiem L15-Medium zeigen ein relativ konstantes pH-Niveau bei pH 6,6, während der pO2-Wert ebenfalls in der ersten Stunde auf einen Tiefstand von 40 % a.s. fällt und dann nach 2 Stunden bei 47 % a.s. verharrt (violette Kurven).

Das der Zellkultur zugesetzte Antimycin A (hellblaue Kurven) führt zu einem raschen Anstieg des O2-Gehalts auf Luftsättigung innerhalb von 2 Stunden aufgrund der Hemmung der mitochondrialen Elektronentransportkette, insbesondere von Komplex III, was zu einem starken Rückgang des Sauerstoffverbrauchs führt, da die Zellatmung blockiert ist. Diese Unterbrechung führt auch zu einem Absinken des pH-Werts auf 5,5 innerhalb der ersten 4 Stunden, da die Zellen auf anaerobe Glykolyse umschalten und Milchsäure als Nebenprodukt produzieren. Malonoben hemmt den mitochondrialen Komplex II, wodurch der Sauerstoffverbrauch durch Beeinträchtigung des Elektronenflusses durch die Atmungskette verringert wird. Dies führt zu einem Absinken des pH-Werts, da die Zellen dies durch eine verstärkte anaerobe Glykolyse kompensieren, was zu einer erhöhten Laktatproduktion führt. Daher sinkt der O2-Gehalt innerhalb der ersten Stunden schnell auf 22 %, und der pH-Wert sinkt stetig, um nach etwa 9 Stunden ein Plateau bei pH 5,5 zu erreichen (orangefarbene Kurven). Das Pestizid Acetamiprid als Testsubstanz führte zu einem schnellen Anstieg des O2-Gehalts auf lediglich konstante 90 % a.s. und zu einem Absinken des pH-Werts auf pH 6,1 in den ersten zwei Stunden nach dem Start, wo er konstant bleibt (dunkelblaue Kurven).

Zusammenfassung & zukünftige Anwendungen

Wie in diesem Proof-of-Concept-Bericht gezeigt wird, ermöglicht die PhoxyCube-Überwachungsplattform einen detaillierten Einblick in jede Phase der Zellkulturexperimente. Die gleichzeitige Überwachung von Sauerstoff und pH-Wert in Echtzeit bietet die Möglichkeit, Stoffwechselveränderungen direkt zu beobachten und bei Bedarf entsprechende Anpassungen vorzunehmen. In den hier beschriebenen Experimenten hat PhoxyCube bereits seinen Wert bei der Überwachung von Zellkulturen und der Durchführung von Toxizitäts- und Arzneimitteltests unter Beweis gestellt, kann aber auch in anderen Forschungsbereichen eingesetzt werden. PhoxyCube wird demnächst in Hypoxie-Studien und beim Tissue Engineering eingesetzt und wird die Optimierung von Assays (Zelllinie, Mediumzusammensetzung usw.) beschleunigen.

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