Messungen der Sauerstoffverbrauchsrate in geschlossenen Mikrorespiratoren

Bei der Anwendung auf Samen, wie in diesem Anwendungsbericht beispielhaft dargestellt, verdeutlicht die Sauerstoffdynamik den metabolischen Umschaltvorgang, der den Übergang von der Ruhephase zum aktiven Wachstum kennzeichnet. Dieses Verfahren erfasst die Imbibitionsverzögerung der Samen, den Beginn der Atmungsaktivierung und den anhaltenden Sauerstoffverbrauch während der Keimung – Kennzahlen, die die Keimkraft quantifizieren, frühe Schäden erkennen und Priming- oder Stressbehandlungen auf skalierbare und reproduzierbare Weise durch die Bewertung der jeweiligen Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) bewerten.

Einzelne Brokkoli- und Weißkohlsamen dienen in dieser Atmungsstudie als Proben. In jede Vertiefung einer 96-Well PhoxyPlate 96 O wurden 100 µl einer 2 %-igen (w/v) Phytagel-Lösung bei 80 °C gegeben. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur bildete das Phytagel eine stabile Gelschicht. Nach dem Abkühlen des Gels wurde in jede Vertiefung ein einzelner Samen auf das Phytagel gelegt. Die Platte wurde vertikal in zwei Hälften für die beiden Saatgutarten geteilt. Eine Reihe diente als Blindkontrolle (Abb. 2). Das Hydrogel erfüllt in dieser Studie mehrere Zwecke: Es stellt ein definiertes Wasserreservoir bereit, das zur Aktivierung der Samen benötigt wird, hält die Luftfeuchtigkeit in den Kammern konstant und verhindert den direkten Kontakt des Samens mit dem Sensormaterial am Boden der Vertiefung, wodurch mögliche starke lokale Schwankungen am Sensor vermieden werden, die zu einer Messverzerrung führen würden. Nach dem Einbringen der Samen in die Vertiefungen wurde die Platte mit einer Aluminium-Versiegelungsfolie für Wellplatten versiegelt, um das Eindringen von Umgebungsluft zu verhindern. Die Proben wurden in einen temperaturgeregelten Schrank bei 18 °C und 1 atm Luftdruck gestellt und über einen Zeitraum von insgesamt ~ 6 Tagen alle 5 Minuten überwacht.

Samen durchlaufen eine anfängliche Imbibitionsphase (Tag 0 - 2), in der sie Wasser aufnehmen und aktiviert werden. Samen, die ihren Keimungsprozess beginnen (Tag 2 - 3), aktivieren damit ihren Stoffwechsel, was aufgrund der Atmung zu einem stärkeren Sauerstoffverbrauch führt. Die O₂-Werte in den geschlossenen Atmungskammern sinken mit der Zeit. Bei 5 von 42 untersuchten Weißkohlsamen (in den Vertiefungen A5, E4, E5, F3, F5) wurde nach der Imbibitionsphase kein Sauerstoffabfall festgestellt, was ein eindeutiges Anzeichen für eine fehlgeschlagene Keimung ist (siehe Abb. 3). Die Nichtkeimrate der untersuchten Weißkohlsamen betrug 88 %, verglichen mit einer Keimrate von 100 % bei den untersuchten Brokkolisamenproben.

Diese Studie konzentriert sich auf die primäre Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) während der Keimphase, in der im Vergleich zur Imbibitionsphase eine höhere Stoffwechselaktivität zu beobachten ist. Aus jeder parallelen Atmungsmessung lässt sich die steilste O₂-Änderung in % a.s. pro Stunde bestimmen. Daher wird die maximale OCR pro Vertiefung (Abb. 4) aus dem Sauerstoffabfall zwischen zwei einzelnen Messpunkten im Zeitintervall von 4 Stunden berechnet. Das gewählte Zeitintervall kann für Proben mit höherer oder niedrigerer Atmungsaktivität angepasst werden. Für die relativ langsame Atmung kleiner Samen ist ein 4-Stunden-Intervall eine gute Grundlage.

Der pO₂-Wert in % a.s. kann mittels eines Umrechnungsfaktors in O₂-Mengen in Mol oder nmol umgerechnet werden, wobei es sich um eine auf der Stoffmenge basierende Einheit handelt. Bei einem Einphasensystem ist dies einfach, indem entweder das ideale Gasgesetz (gasförmiges System) oder das Henrysche Gesetz (wässriges System) angewendet wird. Im gezeigten Beispiel enthielt jede Vertiefung 100 µl Phytagel-Hydrogel und 260 µl Luft im Kopfraum und stellt somit ein Zweiphasensystem dar. Unter der Annahme eines Gleichgewichts zwischen den beiden Phasen lässt sich die Gesamtsauerstoffmenge bei 18 °C und 1 atm Druck aus dem idealen Gasgesetz für die Luftphase (1 % a.s. pO₂ = 22,3 nmol) + dem gelösten Sauerstoff in 100 µl wässriger Phase (1 % a.s. pO₂ = 0,254 nmol) nach dem Henry-Gesetz berechnen. Der Gesamtumrechnungsfaktor für das Zweiphasensystem wurde mit 1 % a.s. pO₂ = 22,6 nmol O₂ berechnet. Der durchschnittliche OCR für die beiden untersuchten Probentypen beträgt 49,8 ± 15 nmol/Stunde pro Weißkohlsamen (ohne die 5 nicht keimenden Proben) und 69,6 ± 20 nmol/Stunde pro Brokkolisamen.

Das hier vorgestellte 96-Well-Format mit geschlossener Kammer, bestehend aus dem PhoxyCube und den mit Sensoren ausgestatteten Well-Platten PhoxyPlate 96 O, ermöglicht echte parallele, zeitaufgelöste Atmungsmessungen – wobei jede Vertiefung als eigenständiges Respirometer fungiert –, während gleichzeitig der Gasaustausch mit der Umgebung und Kreuzkontaminationen verhindert werden. Diese Konfiguration liefert skalierbare, quantitative Messwerte (z. B. maximaler O₂-Abfall, umgerechnet in nmol (O₂) pro Stunde) und unterstützt anpassbare Probenahmeintervalle, um unterschiedlichen Atmungsraten gerecht zu werden. Über den Einsatz bei Samen hinaus kann der Ansatz mit verschiedenen kleinen biologischen Proben oder Behandlungen für die Hochdurchsatz-Phänotypisierung, Dosis-Wirkungs-Tests und zeitliche kinetische Studien genutzt werden.