Messungen der Sauerstoffverbrauchsrate von MDCKII-Zellen

Dieser Anwendungsbericht beschreibt zwei unterschiedliche Methoden zur Berechnung der Sauerstoffverbrauchsrate (kurz: OCR) in adhärenten MDCKII-Zellen, die in einer 96-Well PhoxyPlate 96 O Platte mit dem PreSens PhoxyCube Reader gezüchtet wurden. Im anfänglichen kinetischen Fenster jeder Messung kommt es unmittelbar nach Beginn des Experiments zu einem raschen Abfall des gelösten Sauerstoffs – eine Phase, in der die Zellatmung den Sauerstofftransport durch Diffusion an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche deutlich übersteigt. Im Gegensatz dazu nutzt die Steady-State-Diffusionsmethode das thermodynamische Gleichgewicht, bei dem der Sauerstofftransport aus der Luft den Stoffwechselverbrauch der Zellen ausgleicht. Dieser Bericht erläutert die mathematischen Grundlagen und physikalisch-chemischen Parameter, wie beispielsweise den volumetrischen Stoffübergangskoeffizienten k_La, die für diese Berechnungen erforderlich sind. Durch den Vergleich beider Strategien wird aufgezeigt, wie Forscher sowohl die Sauerstoffverbrauchsrate als auch die langfristige physiologische Stabilität bewerten können. 

Der Sauerstoffstatus adhärenter MDCKII-Zellen wurde während der Kultivierung in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ in 20-minütigen Messintervallen mithilfe des PhoxyCube Geräts überwacht, das mit einer 96-Well Sensorplatte (PhoxyPlate 96 O) mit O₂-Sensoren in jeder Vertiefung sowie einem Wellplatten-Deckel ausgestattet war. Der Deckel ermöglicht einen ausreichenden Gasaustausch mit der Inkubatorluft, sodass das System als offenes System definiert ist. Die PhoxyPlate wurde 1 Stunde lang bei 37 °C im Inkubator in mit 95 % Luft gesättigtem (5 % CO₂) Medium voräquilibriert, gefolgt von einer Einpunktkalibrierung bei 95 % a.s.. MDCKII-Zellen wurden in 300 µl Phenolrot-freiem MEM-Wachstumsmedium (Gibco) + 5 % FCS + Glukose mit einer Aussaatdichte von 450 T/cm² ausgesät, wodurch eine konsistente 2D-Zellschicht mit ~144.000 Zellen pro Vertiefung entstand. 8 Vertiefungen dienten als Blindkontrolle ohne Zellen. Nach ~26 Stunden wurde in allen Vertiefungen frisches Wachstumsmedium ausgetauscht und die Messung fortgesetzt.

Acht einzelne Vertiefungen wurden jeweils zu einer Replikationsgruppe zusammengefasst. In der Anfangsphase während der ersten 1 - 2 Stunden nach der Beimpfung oder dem Medienwechsel zeigen alle Gruppen, die Proben enthalten, einen steilen Abfall des O₂-Gehalts aufgrund der starken Respiration von MDCKII-Zellen unter nicht physiologisch regulierten Bedingungen im Vergleich zur Rediffusion über die Medien-Luft-Grenzfläche (siehe Abbildung 2). Auf diesen Abfall folgt ein moderaterer Rückgang im physiologisch relevanten Zellzustand (2 - 16 Stunden nach Beginn oder Medienwechsel). In diesem Bericht konzentrieren wir uns auf die OCR in diesem physiologisch relevanten Zellzustand. Dieser Abfall erzeugt eine quasi-lineare Abnahmekurve, bei der die Diffusion noch vernachlässigbar ist. Nach etwa 16 Stunden erreicht der O₂-Verbrauch den thermodynamischen Gleichgewichtszustand, und die O₂-Sättigung bleibt in allen Wells konstant zwischen 2,9 und 7 % a.s., wobei sich O₂-Verbrauch und Rediffusion ausgleichen.

Zur Berechnung von OCR_kin sind drei Schritte erforderlich:

1. Ermitteln Sie die Steigung und berechnen Sie die Rate des Sauerstoffabfalls pro Minute,
2. Rechnen Sie die Konzentrationsänderung in eine absolute Menge pro Vertiefung um,
3. Berechnen Sie die OCR pro 1000 Zellen in (mol/min · 1000 Zellen)

Das kinetische Zeitfenster wurde auf 2 bis 5 Stunden nach dem Medienwechsel festgelegt. Die Steigung des Abfalls Δc(O₂ in % a.s.) / Δt der Gruppen wurde mit einem Δt von 120 Minuten und einem gleitenden Durchschnitt von 5 aufeinanderfolgenden Messpunkten bestimmt (siehe Abb. 3). Die berechnete Steigung wird in die Einheit µmol/L/min umgerechnet, die bei OCR-Berechnungen üblicher ist.  Das Medienvolumen von 300 µl und die Anzahl der ausgesäten Zellen (~144.000 Zellen) pro Vertiefung werden dann zur Bestimmung der OCR_kin jeder Gruppe herangezogen. Die ermittelte durchschnittliche OCR_kin betrug 0,173 ± 0,012 pmol/min/1000 Zellen.

Die Berechnung des OCR_eq erfordert

1. den volumetrischen Stoffübergangskoeffizienten kLa 
2. den O₂-Gehalt im Gleichgewicht zwischen Zufuhr und Verbrauch, gemessen mit dem PhoxyCube
3. die Berechnung des Diffusionsflusses im Gleichgewicht und damit des OCR_eq pro Zelle.

k_La wurde einfach durch Auswertung der kinetischen Phasendaten aus Methode 1 bestimmt. Der Sauerstoffverbrauch bleibt während des gesamten Experiments in Abb. 3 konstant. Daher berechneten wir k_La durch Umformung der Diffusionsgleichung im stationären Zustand und unter Verwendung der gemessenen mittleren O₂-Gleichgewichtskonzentration (3,8 % a.s.) sowie der OCR_kin (abgeleitet aus der kinetischen Methode) zu k_La = 0,00042 min^-1. Dieser Kalibrierungsansatz erfordert keine externen Annahmen hinsichtlich der Well-Geometrie oder der Oberflächeneigenschaften. Er ermöglicht eine zuverlässige Berechnung der Atmungsraten aus Gleichgewichtsmessungen in nachfolgenden Zeitexperimenten, solange das verwendete Volumen konstant gehalten wird.
Der berechnete durchschnittliche OCR_eq aller Gruppen wurde auf 0,168 ± 0,001 pmol/min/1000 Zellen bestimmt und stimmte mit dem kinetisch ermittelten OCR bis auf 3 % überein. 

PhoxyCube ermittelt den OCR von Zellkulturen auf zwei einfache Arten: entweder mithilfe der kinetischen Methode oder einfach aus dem Gleichgewichtszustand, sofern k_La aus einer Vorabmessung oder aus der Literatur bekannt ist. Diese auf dem Gleichgewicht basierende OCR-Berechnung macht zeitkritische kinetische Messungen überflüssig und eignet sich somit ideal für das Hochdurchsatz-Screening der Atmungsdynamik über längere Kulturzeiträume. 
Das PhoxyCube in Verbindung mit PhoxyPlate 96 O - Sensor-bestückten Well-Platten - eröffnet das Potenzial für Hochdurchsatz-Tests zur Bestimmung der kinetischen und thermodynamischen Gleichgewichts-OCR hinsichtlich der Auswirkungen pharmazeutisch wirksamer Verbindungen auf die Zellatmung, wie beispielsweise Dosis-Wirkungs-Studien an adhärenten Zellkulturen oder Zytotoxizitätsstudien.