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pH-Überwachung in Urin und Tumor-Mikroumgebungen von Ratten

Messungen mit hoher räumlicher Auflösung gesteuert mit dem manuellen Mikromanipulator

T. Kiskova1, Z. Steffekova2, M. Karasova2, N. Kokosova1
1P. J. Šafárik Universität in Košice, wissenschaftliche Fakultät, Košice, Slowakei
2Universität der Veterinärmedizin und Pharmazie in Košice, Slowakei

Ziel unserer Studie war es, den pH-Wert von Urinproben (< 100 μL) und von Tumor-Mikroumgebungen anästhesierter Ratten minimal-invasiv zu überwachen. Die kleinen Urinvolumina von Ratten oder Mäusen machen pH-Messungen schwierig, da Standard-pH-Elektroden normalerweise ein minimales Volumen von einigen Millilitern benötigen, um zu funktionieren. Die Menge an Rattenurin beträgt jedoch häufig < 100 μL, wie in unserer Studie. Zusätzlich ist das in vivo pH-Monitoring von Tumor-Mikroumgebungen technisch ziemlich schwierig. Der PreSens Manuelle Mikromanipulator (MM) zusammen mit einem nadelförmigen (NTH) pH-Mikrosensor bot eine einfache und effektive Möglichkeit, diese Experimente durchzuführen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass der pH-Wert von Urin und Tumor-Mikroumgebungen bei tumortragenden Ratten im Vergleich zu gesunden Individuen und Geweben niedriger war.

Solide Tumoren enthalten verschiedene Zelltypen wie Krebszellen, Stroma- oder Immunzellen, aber auch Proteine ​​und verschiedene Botenstoffe [1]. Die Interaktion zwischen diesen Zellen bildet die einzigartige Mikroumgebung des Tumors und beeinflusst sowohl das Tumorwachstum als auch die Tumorentwicklung [2]. Infolgedessen wurden pH-Unterschiede in der Tumor-Mikroumgebung beobachtet. Während der extrazelluläre pH-Wert von malignen soliden Tumoren sauer ist, im Bereich von 6,5 bis 6,9, ist der pH-Wert normalen Gewebes um 7,2 bis 7,5 signifikant alkalischer [3]. Das systemische Säure-Basen-Gleichgewicht wird zu großen Teilen durch renale Ausscheidung von überschüssigen Ionen in den Urin aufrechterhalten. Die Zusammensetzung der Nahrung, das Körpergewicht sowie der pathologische Zustand, z. B. Krebs, können den Urin-pH-Wert durch die Produktion bestimmter Ionen und organischer Säuren beeinflussen [4]. Wir testeten daher die Hypothese, ob die Tumorbildung bei Ratten einen Einfluss auf den pH-Wert des Urins hat. In unseren Experimenten wurde ein mikrofaseroptisches pH-Meter mit einem pH-Mikrosensoren in Nadelbauweise (PreSens, Deutschland) verwendet. Die pH-Mikrosensoren sind miniaturisierte Glasfaser-pH-Sensoren mit Sensorspitzen unter 150 μm, die für Messung kleiner Probenvolumina und mit hoher räumlicher Auflösung ausgelegt sind. Für Messungen innerhalb des Tumorgewebes wurde zusätzlich ein Manueller Mikromanipulator (MM, PreSens, Deutschland) eingesetzt, der eine sicheres Einführen des Mikrosensors und eine präzise Lokalisierung innerhalb der Probe ermöglicht.

Material & Methoden

Weibliche Sprague-Dawley-Ratten (n = 20) mit einem Alter von 31 Tagen und einem Gewicht von 100 - 130 g wurden von Velaz (Únetice, Tschechische Republik) bezogen und an Standard-Gehegebedingungen mit einer Temperatur im Bereich von 21 bis 24 ºC, einer relativen Feuchtigkeit von 50 % - 65 % und künstlichem 12:12 h Licht:Dunkel-Zyklus gewöhnt. Die Ratten wurden mit Standardpellets (Peter Miško, Slowakei) gefüttert und tranken nur Leitungswasser. Brustkrebs wurde bei 10 Tieren (NMU-Gruppe) durch 2 intraperitoneale Dosen (50 mg/kg Körpergewicht) von N-Methyl-N-Nitrosoharnstoff (NMU, Sigma, Deutschland) am 43. und 50. postnatalen Tag induziert. Die restlichen 10 Tiere bildeten die gesunde Kontrollgruppe (CON). Das Experiment wurde nach den Grundsätzen, die laut den Gesetzen Nr. 377 und Nr. 436/2012 der Slowakischen Republiken für die Pflege und Verwendung von Labortieren vorgesehen sind, durchgeführt. Mit dem Ziel, den pH-Wert der Tumorentwicklung über die Zeit zu überwachen, wurden 5 Ratten zufällig ausgewählt und über einen Zeitraum von 4 Wochen (10. bis 13. postnatale Woche) einmal pro Woche anästhesiert. Die Anästhesie erfolgte mit Isofluran, das unter einem doppelten Boden in eine Induktionskammer von 1000 ml Kapazität eingeleitet wurde. Eine 4%-ige Konzentration von Isofluran-Gas war ausreichend für Kurzzeitanästhesie (0,2 ml/l Kammervolumen). Eine schematische Darstellung des Versuchsaufbaus für pH-Messungen in Tumorgewebe ist in 2 gezeigt. In der letzten Woche des Experiments (14. postnatale Woche) wurden Urinproben von jeder Ratte genommen. Während der Handhabung auf einer sterilen Unterlage begannen die Ratten spontan zu urinieren. Der Urin wurde sofort in sterilen Mikroröhrchen gesammelt. Der pH wurde unter Verwendung von pH-Mikrosensoren (PreSens, Deutschland) nach Sammeln des Urins gemessen. Die Latenzzeit für Messungen in einer Probe lag unter 10 Minuten. Die Daten wurden mit der statistischen Software GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Software Inc., USA) ausgewertet. Die Ergebnisse wurden unter Verwendung eines Mann-Whitney-Tests analysiert. Um zu sehen, ob der pH-Wert von Urin mit der Menge an Tumorgewebe in Ratten korreliert, wurde ein Online-Pearson-Korrelationskoeffizienten-Rechner verwendet (www.soccistatistics.com). Die Signifikanzstufen sind in der Legende jeder Abbildung angegeben.

pH-Meßergebnisse

Wir fanden heraus, dass der pH-Wert der Mikroumgebung des Tumors im Vergleich zum Gewebe gesunder Individuen nur leicht vermindert war (pH 7,24 - 7,33). Leider hat das unkontrollierte Wachstum und die Ausbreitung des Tumorgewebes eine wiederholte Überwachung einer räumlich definierten Tumorregion über mehrere Wochen hinweg erschwert (siehe Abb. 3). Daher konnten unsere Daten keine schlüssigen Ergebnisse darüber liefern, wie sich der pH-Wert während der Tumorbildung verändert. Es gibt einige Studien, die darauf hindeuten, dass sich der pH-Wert des Urins während der Krebsentwicklung trotz des Säure-Basen-Gleichgewichts im Organismus verändert [4]. Unsere Ergebnisse zeigen deutlich pH-Veränderungen im Urin von tumortragenden im Vergleich zu gesunden Tieren (P < 0,001, Tab. 1). Der Urin-pH-Wert zeigte nur eine sehr schwache positive Korrelation (R = 0,21) mit der Menge an Tumorgewebe. Dies ist wahrscheinlich auf die geringe Probenanzahl in diesem Experiment zurückzuführen (n = 10).

Zusammenfassung

pH-Überwachung mit mikro-invasiven, präzisen pH-Mikrosensoren wurde für verschiedene experimentelle Anwendungen eingesetzt, einschließlich für in vivo pH-Messungen von Tumorgewebe und geringen Urinvolumina. Die Anwendung des Manuellen Mikromanipulators mit seiner μm-Ablesegenauigkeit erlaubte uns eine sichere Insertion und präzise Lokalisierung der Mikrosensoren im Gewebe. Während der in vivo pH-Überwachung des wachsenden Tumorgewebes über mehrere Wochen war es jedoch schwierig, eine räumlich definierte Messregion zu bestimmen. Mit einem genaueren Protokoll hoffen wir, pH-Änderungen der Tumorbildung in zukünftigen Versuchen bewerten zu können.

Referenzen
[1] Hanahan D., Weinberg R. A., Cell (2011), 144(5), 646 - 74
[2] Yang L. V., Castellone R. D., Dong L., Cancer Prevention - From Mechanisms to Translational Benefits (2012), 3 - 40
[3] Obey I. F., Baggett B. K., Kirkpatrick N. D., Cancer Res. (2009), 69, 2260 - 68
[4] Wright M. E., Michaud D. S., Pietinen P., et al., Cancer Causes Control (2005), 16(9), 1117 - 23

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