Räumlich-zeitliche O₂ Gradienten in der Mikroumgebung einer auswachsenden Zellfläche

Die O₂-Niveaus in der zellulären Mikroumgebung wurden unter Verwendung des VisiSens TD-Bildgebungssystems quantifiziert und sichtbar gemacht, das mit einer Mikroskopoptik und einer passenden Lichtquelle für die Analytkartierung im kleinen Maßstab ausgestattet war. Das System bietet eine 2-fache Vergrößerung. Ein rundes Stück der O₂-empfindlichen planaren Sensorfolie (SF-RPSu4) mit einem Durchmesser von 0,7 cm wurde unter Verwendung eines biokompatiblen Silikonklebstoffs auf den Boden einer Standard-Petrischale mit einem Durchmesser von 3,5 cm geklebt. Wir ließen den Kleber mindestens 24 Stunden trocknen, bevor die Experimente durchgeführt wurden. Die optische Isolationsschicht wurde von der Sensorfolie entfernt. Vor dem Aussäen der Zellen wurden die Petrischalen, die die Sensorfolien enthielten, 1 Minute lang Argonplasma ausgesetzt, um die Oberfläche zu reinigen und zu sterilisieren (siehe Abb. 1). Um ein kleines Zellfeld zu erzeugen, das kleiner als die Sensorfolie ist, wurden suspendierte Zellen in einen kleinen Einsatz ausgesät. Dieser diente als physikalische Barriere und verhinderte so die Ausbreitung von Zellen auf der gesamten Sensoroberfläche. Die Petrischale war mit einem Deckel bedeckt, der einen kleinen Einlass zum Aussäen der Zellen enthielt. Der Rand des Deckels wurde mit einer dünnen Schicht Blu-Tack® beschichtet und fest auf den unteren Teil am Boden der Petrischale gedrückt. Die mechanische Belastung des Deckels drückte den Barriereeinsatz nach unten, so dass keine Zellsuspension austreten konnte. 100 µl Zellsuspension (2,0 · 10⁵ Zellen cm^-2, Wachstumsfläche = 3,2 mm²) wurden in das innere Kompartiment des Einsatzes gegeben. Die Zellen wurden 24 h bei 37 ° C, 95% Luft und 5% CO₂ inkubiert. Dann wurden Deckel und Einsatz entfernt und die Probe zweimal mit 1 ml L-15-Medium gewaschen. Die Petrischale wurde mit 9,6 ml L-15-Medium gefüllt und mit einem neuen Deckel ohne Öffnung luftdicht verschlossen. Die Zweipunktkalibrierung des O₂-Sensors wurde durch Aufbringen von Zellkulturmedien mit 0% (v / v) O₂ (Medium, ergänzt mit 10 g/l Na₂SO₃, das den gesamten gelösten Sauerstoff reduziert) und mit Umgebungsluft gesättigtem Medium durchgeführt. Die Kalibrierungswerte wurden unter Verwendung des PreSens Oxygen Calculators von % Luftsättigung in Torr umgewandelt. Automatisierte Zeitreihenaufzeichnungen und Auswertungen der O₂-Bilder wurden in der VisiSens ScientifiCal 1 Software durchgeführt.

Anhaftende Zellen, die eine Fläche in der Mitte der Sensorfolie bildeten, konnten frei wandern und sich ausbreiten, nachdem die räumliche Barriere entfernt worden war. Gleichzeitig wurde das O₂ Imaging gestartet und die zeitlichen und räumlichen O₂-Veränderungen während der Migration überwacht (Abb. 2A). Abb. 2B zeigt typische Daten von einem einzelnen Zellfeld als Funktion der Zeit für einen Beobachtungszeitraum von 50 Stunden. Es wurden vier unabhängige Patches untersucht, die ähnliche Ergebnisse ergaben. Die Pseudofarben-O₂-Bilder in 2B zeigen die Bildung eines O₂-Gradienten mit niedrigeren O₂-Konzentrationen in der Mitte des Feldes, verursacht durch Zellatmung. Die Zellen in der Mitte sind von anderen atmenden Zellen umgeben, so dass kein radialer Sauerstoffzufluss erfolgt. Zellen in der Peripherie sind von Medium umgeben, so dass der verbrauchte Sauerstoff zusätzlich durch laterale Diffusion von der Peripherie und nicht nur durch Sauerstoffdiffusion von Flüssigkeitsschichten über den Zellen wieder aufgefüllt wird. Nach 10 Stunden ist die leichte Hypoxie, die durch das aktiv atmende Zellfeld verursacht wird, deutlich sichtbar. Innerhalb der nächsten 10 Stunden nahm die Steilheit des O₂-Gradienten zwischen den Zellen und dem peripheren Medium weiter zu, was zu einer hypoxischen zentralen Patch-Region führte. Die Größe des hypoxischen Bereichs nahm während der Messung zu, da sich das Zellpflaster aufgrund von Zellmigration und -proliferation ausdehnte.

Der zeitliche Verlauf der O₂-Abnahme in einem bestimmten ROI (Region of Interest) hängt von seiner Position relativ zu der von der Zellschicht bedeckten Fläche ab. Abb. 3A zeigt drei ausgewählte ROIs (jeweils 85 × 80 px) von einer unterschiedlichen Position des anfänglichen Zellfeldes (ROI 1: Zentrum des Zellfeldes, ROI 2: Randbereich des Zellfelds) oder vom anfänglich zellfreien O₂-Sensorbereich (ROI 3). pO₂-Werte des anfänglich zellbedeckten Bereichs können leicht von Werten unterschieden werden, die für die anfänglich zellfreie Sensoroberfläche bestimmt wurden. Die pO₂-Werte bei t = 0 Std. reichen von anoxischen Werten von (142 ± 10) Torr für ROI 3 bis zu geringfügig niedrigeren pO₂-Werten von (119 ± 9) Torr für ROI 1 und (121 ± 10) Torr für ROI 2. Aufgrund des zellulären O₂-Verbrauchs sanken die O₂-Spiegel in der Mitte des Zellfeldes (ROI 1) innerhalb von 40 Std. um etwa 90 % auf (14 ± 4) Torr und erreichten nach 69 Std. Imaging (1 ± 3) Torr. Am Rand des MDCK II-Feldes (ROI 2) fielen die O₂-Werte nach 40 Std. Imaging um etwa 65 % auf einen Wert von (44 ± 6) Torr und erreichten schließlich pO₂-Werte von (7 ± 4) Torr. Dieses Ergebnis ähnelt dem ROI 1, was darauf hinweist, dass während der Messung Zellen über die Sensoroberfläche gewachsen und gewandert sind, sodass sich das ROI 2 nicht mehr im Randbereich des Feldes, sondern in der Mitte befindet. Dieser Trend zeigt sich auch an der zunächst zellfreien Sensorstelle (ROI 3). O₂ bleibt nicht bei den anfänglichen normoxischen Werten und beginnt nach ca. 15 Std. stark abzufallen, zunächst aufgrund einer Diffusionsverarmung im Medium und anschließend aufgrund der Bedeckung durch atmende Zellen und deren Mikroumgebung. Die O₂-Spiegel wurden bei t = 40 Std. auf (77 ± 10) Torr quantifiziert und fielen nach 69 Std. Imaging weiter auf (25 ± 6) Torr ab.
Da die Zellen auf der opaken Sensorfolie durch Phasenkontrastmikroskopie nicht direkt zugänglich sind, wurde das Wachstum und die Migration von MDCK II durch Anfärben der Zellen mit Carbolfuchsin dokumentiert. Die gefärbte Probe wurde durch Stereomikroskopie analysiert. Abbildung 2B zeigt die gefärbten Zellen unmittelbar nach dem Entfernen der Barriere bei t = 0 Std. und nach 40 Std. Imaging. Die anfängliche Größe der Fläche betrug etwa 3,3 mm² und stieg bei t = 40 Std. etwa 8-fach auf 27,3 mm² an. Die Zellen verteilten sich während der experimentellen Beobachtungszeit von 40 Std. sowohl auf der O₂-Sensorfolie als auch auf der Petrischale.

Das VisiSens TD MIC-System ermöglicht die quantitative Abbildung der zeitlichen und räumlichen Änderungen des O₂-Verbrauchs anhaftender Zellmonoschichten in Echtzeit. Unsere Studie zeigt, dass die O₂-Niveaus in der direkten Mikroumgebung unter den Zellen, die auf der Sensorfolie wachsen, bestimmt werden. Da (I) der Abstand zwischen Plasmamembran und Sensorfolie in der Größenordnung von 100 nm liegt und (II) die Plasmamembran für molekularen Sauerstoff hoch durchlässig ist, spiegeln die vom Sensor angegebenen Sauerstoffwerte die Sauerstoffwerte im Zytoplasma wider. An verschiedenen Stellen der wachsenden Zellmonoschicht werden starke räumliche und zeitliche Änderungen des Sauerstoffgehalts beobachtet, was darauf hinweist, dass die Zellen innerhalb einer nachwachsenden Zellschicht abhängig von ihrer Position in der Zellschicht sehr unterschiedliche Stoffwechselsituationen (aerob oder anaerob) erfahren. Diese lokal unterschiedlichen Sauerstoffniveaus können eine Quelle für Heterogenität sein, die häufig in Zellpopulationen beobachtet wird, die nominell unter genau den gleichen Kulturbedingungen kultiviert wurden. Mit den VisiSens TD MIC-Systemen können lokale Unterschiede in der Stoffwechselleistung und alle daraus abgeleiteten Konsequenzen bewertet werden.