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Überwachung der Sauerstoffversorgung von Hautgewebe bei Mäuse
Vergleich von VisiSens™ mit anderen Sauerstoffmessmethoden
Julian Hofmann1, Robert M. Meier2, Alexander Mahnke1, Valentin Schatz1, Gregor Liebsch3, Otto Wolfbeis2, und Jonathan Jantsch1
1Mikrobiologisches Institut - Institut für klinische Mikrobiologie, Immunologie and Hygiene, Universitätsklinikum Erlangen, Deutschland
2Institut für analytische Chemie, Chemo- and Biosensoren, Universität Regensburg, Deutschland
3PreSens GmbH, Regensburg, Deutschland
Es besteht großes Interesse daran, mehr über die Rolle der Sauerstoffversorgung von Gewebe während verschiedener Krankheiten zu erfahren. In dieser Studie wurden drei verschiedene Messtechniken, einschließlich des VisiSens™ Sauerstoff-Bildgebungssystems, zur Quantifizierung der Sauerstoffspannung der Haut von Mäusen verwendet. Im Vergleich zu Messungen mit Elektroden vom Clark-Typ sind Sauerstoffmessungen mit VisiSens™ einfach durchzuführen und das System bietet den großen Vorteil, dass Messungen nicht-invasiv vorgenommen werden können.
Bekannte pathologische Faktoren, die zu einer schweren Gewebehypoxie führen, sind Krebs und Ischämie. Darüber hinaus sind Infektionen und Entzündungen in einem lebenden Organismus häufig mit sehr geringen Sauerstoffspannungen in den betroffenen Geweben verbunden. Daher ist es besonders wichtig, die Rolle der Sauerstoffversorgung des Gewebes bei verschiedenen Erkrankungen zu verstehen. Das kann jedoch nur untersucht werden, wenn die Sauerstoffversorgung des Gewebes zuverlässig bestimmt werden kann. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Methoden entwickelt, aber die meisten davon liefern keine exakten Werte. Daher werden polarographische Sauerstoffsensoren immer noch als "Goldstandard" zur Messung der Sauerstoffspannung angesehen. Dieses Verfahren ist jedoch invasiv, die Elektrode selbst verbraucht Sauerstoff und verändert dadurch ihre Sauerstoff-Mikroumgebung, und es können nur Einzelpunktmessungen vorgenommen werden, was es äußerst schwierig macht, die Sauerstoffverteilung im Gewebe in reproduzierbarer Weise abzubilden. Eine neuere Entwicklung in der Sauerstofferfassung ist die Verwendung von lumineszierender optischer Bildgebung unter Verwendung von sauerstoffempfindlichen Farbstoffen, deren Lumineszenz in Abhängigkeit von Sauerstoff abgeschwächt wird. Diese Farbstoffe sind in einer sauerstoffdurchlässigen Polymermatrix-Schicht immobilisiert. Die Sauerstoffverteilung wird durch Lumineszenz-basierte Auslesetechniken, wie Messung der Intensitäten, Fluoreszenzlebensdauer (FLIM) oder der Signale bei zwei Wellenlängen (Ratiometrie) bestimmt. Hier wollten wir drei Methoden zur Quantifizierung der Sauerstoffspannung der Haut bei Mäusen vergleichen, nämlich die polarographische Elektrodentechnik und zwei Systeme, die lumineszierende optische Sensorfolien mit speziellen Bildgebungstechnologien kombinieren - eines davon ist das VisiSens ™ A1-Imagingsystem.
Material & Methoden
Weibliche C57BL/6-Mäuse wurden fixiert, und eine Hinterpfote für ca. 5 Minuten auf eine Heizfolie (40 °C) gelegt, um die Diffusion von Sauerstoff durch die Haut zu fördern. Die Elektroden vom Clark-Typ (Ox-100, Unisense, Dänemark) wurden vor der Verwendung in sauerstofffreiem (unter Verwendung von Na2S2O5) und luftgesättigtem Wasser bei 37 °C kalibriert. Angespitze Mikroelektroden (100 μm im Durchmesser) wurden in die erhitzte Haut des Fußballens gestochen. Ein Mikromanipulator wurde verwendet, um in einer standardisierten Weise zu messen. Die Messungen wurden im Zeitverlauf zweimal pro Sekunde aufgezeichnet, und die Daten wurden unter Verwendung der bereitgestellten Software Sensor Trace PRO 3.1.3 ausgewertet. Messungen unter Verwendung von Fluoreszenz-ratiometrischer Bildgebung (FRIM) oder Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebung (FLIM) durch optisches Auslesen wurden wie folgt durchgeführt: Jeder Mausfuß wurde auf einer selbstklebenden Heizfolie fixiert (Abb. 1A). Ein Wassertropfen wurde auf den Fuß aufgebracht, bevor er mit einer lumineszierenden Sauerstoffsensorfolie bedeckt wurde. Die Folie befand sich somit in engem Kontakt mit der Haut und es wurde sichergestellt, dass zwischen Sensor und Fuß keine Luftblasen eingeschlossen waren, die zu fehlerhaften Messungen geführt hätten. Der Sensor wurde zusätzlich mit transparentem Klebeband an der Pfote befestigt (Abb. 1B). Kein übermäßiger Druck wurde auf den Fuß ausgeübt. Die Messungen wurden nach 5 Minuten Äquilibrierungszeit begonnen. FLIM wurde unter Verwendung eines Systems durchgeführt, das eine zeitgesteuerte CCD-Kamera, pulsierbare 460 nm-LEDs und optische Filter umfasste. FLIM-Sensorfolien wurden mit unterschiedlichen pO2-Werten vorkalibriert, die mit einem Gasmischgerät erzeugt wurden. Die Daten wurden mit der mitgelieferten Software analysiert (Image X TG1 v 4.0). Der Untersuchungsbereich (ROI = Region of Interest) der Messung wurde als eine Fläche von 40 x 40 Pixel in der Mitte des verwendeten Sensors definiert. VisiSens™ Sensorfolien (SF-RPSu4, PreSens) wurden vor der Verwendung mit Na2S2O5 kalibriert. Die Signale wurden in einer abgedunkelten Umgebung mit dem Prototyp der VisiSens™ Detektoreinheit DU01 (FRIM-Gerät) aufgezeichnet, der auf einem Stativ montiert war. Die Analyse der Daten wurde mit der mitgelieferten VisiSens™ AnalytiCal 1 Software durchgeführt.
Messungen mit Clark-Elektrode
Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse für Messungen mit einer zugespitzten Clark-Mikroelektrode, die mit einem Mikromanipulator in die Haut der Maus geschoben wurde. Der Druck, der von der Spitze der Mikroelektrode ausgeübt wurde, verursachte eine lokale Ischämie des Hautgewebes, unmittelbar bevor die Spitze die Haut durchdrang. Nach der Penetration wurde der lokale Druck und damit die druckinduzierte lokale Ischämie sofort abgebaut, was zu einer Erhöhung der Sauerstoffsättigung führte. Die Mikroelektrode wurde nicht weiter in das Gewebe vorgeschoben und die Sauerstoffsättigung der Haut wurde über ungefähr 10 Sekunden aufgezeichnet. Schließlich wurde die Mikroelektrode aus dem Gewebe entfernt. Zusammenfassend zeigen Experimente mit Elektroden vom Clark-Typ, dass die mittlere Sauerstoffsättigung der Haut bei Mäusen 4,8 % ± 1,8 % beträgt (Mittelwert ± Standardabweichung, n = 7).
FLIM-basierte Messungen
Es wurden schnelle Imaging-Messungen mit der FLIM-basierten Bildgebungstechnologie durchgeführt und die Ergebnisse sind in Abbildung 3 gezeigt. Zusammengefasst zeigten diese Experimente, dass die mittlere Hautsauerstoffsättigung bei 5,5 % ± 0,9 % liegt (Mittelwert ± Standardabweichung, n = 14, Abb. 3B).
FRIM-basierte Messungen
Die Ergebnisse der ratiometrischen Messungen mit dem VisiSens™ Sauerstoffbildgebungssystem sind in Abbildung 4 dargestellt. Zusammengefasst zeigen diese Experimente, dass die mittlere Hautsauerstoffsättigung 5,4 % ± 0,8 % beträgt (Mittelwert ± Standardabweichung, n = 16; Abb. 4B).
Zusammenfassung
Wir haben das VisiSens™ Sauerstoff-Bildgebungssystem gegen die Clark-Mikroelektrode und ein FLIM-basiertes optisches Sauerstoff-Bildgebungssystem zur Bestimmung der Sauerstoffsättigung der Haut bei Mäusen validiert. Unsere Daten zeigen, dass die transkutane Bildgebung der Hautsauerstoffspannung mit VisiSens™ oder dem FLIM-basierten optischen Sauerstoff-Imagingsystem die gleichen Sauerstoffkonzentrationen liefert wie invasive Messungen mit klassischen Clark-Mikroelektroden. Darüber hinaus entsprechen die von uns gemessenen Sauerstoffsättigungswerte der Haut einem Bericht von Sheffield et al., der beobachtete, dass das Hautgewebe eine Sauerstoffsättigung zwischen 4 und 6 % aufweist. Im Gegensatz zu Clark-Mikroelektroden sind Sauerstoffmessungen, die mit dem VisiSens™ System gemacht werden, einfacher durchzuführen. Darüber hinaus erlaubten optische Sensoren eine nicht-invasive Quantifizierung der Sauerstoffversorgung des Hautgewebes über eine große Hautfläche. Daher ist das FRIM-basierte optische Sauerstoff-Bildgebungssystem VisiSens™ ein perfektes Werkzeug zur Analyse der Sauerstoffversorgung des Hautgewebes. Diese Technologie wird unser Verständnis der lokalen Regulation der Gewebeoxygenierung und ihres Einflusses auf die Pathogenese von Krebs, Infektionskrankheiten und Herz-Kreislauf-Erkrankungen voranbringen.
Applikationsbericht nach
J. Hofmann, R. J. Meier, A. Mahnke, V. Schatz, F. Brackmann, R. Trollmann, C. Bogdan, G. Liebsch, X. Wang, O. S. Wolfbeis, J. Jantsch, Ratiometric Luminescence 2D In-vivo Imaging and Monitoring of Mouse Skin Oxygenation; Methods Appl. Fluoresc., 2013