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Wirkung der nicht-symbiotischen Hämoglobin-Expression auf den Sauerstoffgehalt in Wurzeln
Sauerstoff-Imaging und Respirationsmessungen in Wurzeln mit VisiSens™
Jagadis Gupta Kapuganti
Biochemistry & Systems Biology, Department of Plant Sciences, University of Oxford, GB
Dieses Projekt zielte darauf ab, die Rolle von pflanzlichem nicht-symbiotischem Hämoglobin und die Regulierung der Atmung durch Stickstoffoxid in Pflanzenwurzeln zu definieren. Wildtyp- und Hämoglobin-überexprimierende Gerstenwurzeln wurden für diese Experimente verwendet. Sauerstoff-Imaging in geschnittenen Wurzeln sowie Atmungsmessungen von Wurzeln in Eppendorf-Röhrchen wurden mit dem VisiSens™ System durchgeführt. Frühere Ergebnisse zeigten, dass die Stickstoffmonoxidproduktion in Hämoglobin-überexprimierenden Pflanzen im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen reduziert ist. Darüber hinaus hemmt Stickstoffmonoxid die mitochondriale Atmung. In diesen Experimenten zeigten Hämoglobin-überexprimierende Wurzeln innere Sauerstoffkonzentrationen von 67 % Luftsättigung, während in den Wildtyp-Wurzeln 85,6 % Luftsättigung gemessen werden konnten. Messungen der Wurzelatmung zeigten, dass Hämoglobin-überexprimierende Wurzeln eine Respirationsrate von 960 nmol/gfw/h aufwiesen, während die Wildtypwurzeln eine Respirationsrate von 730 nmol/gfw/h hatten. Dies stimmt mit früheren Befunden überein und zeigt, wie Stickstoffmonoxid die Atmung hemmt und die Sauerstoffhomöostase erhöht.
Pflanzliche Hämoglobine stellen verschiedene Gruppen von Hämproteinen dar und sind in drei Gruppen unterteilt: Klasse 1 Hämoglobine besitzen eine sehr hohe Affinität zu Sauerstoff. Hämoglobine der Klasse 2 haben eine geringere Sauerstoffaffinität und sind an der Pflanzenentwicklung beteiligt. Hämoglobine der Klasse 3 sind verkürzt und unterscheiden sich sehr von den Hämoglobinen der Klasse 1 und 2. Hämoglobine der Klasse 1 fangen Stickstoffmonoxid (NO) ab, das bei sehr niedrigen Sauerstoffniveaus in Pflanzen produziert wird. Stickstoffmonoxid kann auf verschiedenen Wegen erzeugt werden, die in oxidative und reduktive enzymatische Reaktionen unterteilt sind. Die reduktiven Wege arbeiten unter sauerstoffarmen Bedingungen. Nitrat-Reduktase (NR) reduziert Nitrat zu Nitrit und weiter zu NO. Unter niedrigen Sauerstoffbedingungen (weniger als 1 %) reduziert auch die mitochondriale Elektronentransportkette Nitrit zu NO. Das von Mitochondrien stammende NO ist sehr interessant, da es bekanntlich die Pflanzenatmung reguliert. NO bindet an Cytochrom c Oxidase und hemmt die Atmung, wodurch es die innere Sauerstoffkonzentration erhöhen kann. Dies ist sehr wichtig für das kurzzeitige Überleben von Pflanzen unter z. B. Hochwasserbedingungen. In diesem Projekt wurde untersucht, welche Auswirkungen die nicht-symbiotische Hämoglobin-Expression auf die Atmung der Wurzeln und die Sauerstoffkonzentration im Inneren hat, um neue Einblicke in die Rolle von in vivo erzeugtem NO bei der Pflanzenatmung zu erhalten. Das VisiSens™ Sauerstoff-Bildgebungssystem wurde zur Visualisierung von Sauerstoffverteilungen in geschnittenen Wurzeln und zur Messung der Atmung von Wurzeln in Eppendorf-Röhrchen eingesetzt. Die planaren Sauerstoffsensorfolien ermöglichten die Integration in verschiedene Anordnungen.
Material & Methoden
Wildtyp- (WT) und Hämoglobin-überexprimierende (Hb+) Gerstenpflanzen wurden auf Hydrokulturen gemäß Planchet et al. (2005) gezogen. Die Wurzeln wurden vorsichtig aus den Pflanzen herausgeschnitten und in einen Becher gegeben, der Hydrokulturmedium enthielt. 1 - 2 cm lange Wurzelstücke wurden abgeschnitten und auf einen Objektträger gelegt, der einige Tropfen Nährlösung enthielt. Die sauerstoffempfindliche Sensorfolie (SF-RPSU4, PreSens) wurde in 1 x 2 cm große Stücke geschnitten, auf die Wurzeln gelegt und die interne Sauerstoffverteilung mit der VisiSens™ Detektoreinheit aufgezeichnet. Zur Messung der Atmung wurden 200 mg der Wurzeln in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen gegeben, die 1 ml HEPES pH 7,2 enthielten. Vor dem Hinzufügen der Wurzeln wurden 0,5 x 0,5 cm große Sensorfolienstücke mit Silikonkleber an den Innenwänden der Eppendorf-Tubenkappen befestigt. Die Eppendorf-Röhrchen, die mit den Sensoren und den Wurzeln versehen waren, wurden in einen Heizblock gestellt und auf eine Temperatur von 25 °C eingestellt. Die VisiSens™ Detektoreinheit wurde mit einem Stativ in 2 cm Abstand von der Sensorfolie fixiert, um die beste Auflösung zu erzielen (siehe Abb. 1).
Interner Sauerstoff & Atmung in Wurzeln
Um die Wirkung von in vivo erzeugtem NO auf den inneren Sauerstoffgehalt der Wurzeln zu überprüfen, wurden Wildtyp- und nicht-symbiotisch Hämoglobin-überexprimierende Gerstenpflanzen verwendet. Wurzeln von 3 Wochen alten Pflanzen wurden angeschnitten und die Sauerstoffkonzentration wie oben beschrieben gemessen. Die innere Sauerstoffkonzentration von Hämoglobin-überexprimierenden Gerstenwurzeln betrug 67 % Luftsättigung, während die Wildtypwurzeln Sauerstoffkonzentrationen von 85,6 % Luftsättigung zeigten (siehe Abb. 2). 3D-Sauerstoffdiagramme, die mit der VisiSens AnalytiCal 1 Software erstellt wurden, zeigen deutlich die Sauerstoffkonzentrationen im Wurzelgewebe (Abb. 3). Die Ergebnisse eines derzeit laufenden Projekts (hier nicht gezeigt) zeigen, dass in Wildtyp-Pflanzen mehr Stickstoffmonoxid (NO) vorhanden ist, während in Hämoglobin-überexprimierenden Pflanzen die NO-Produktion im Vergleich zum Wildtyp auf 30 % reduziert ist. NO hemmt die mitochondriale Atmung. Durch die Hemmung der Atmung kann NO die Sauerstoffverfügbarkeit in den Wurzeln erhöhen. Dies muss die zunehmende interne Sauerstoffkonzentration der Wildtypwurzeln im Vergleich zu den Hämoglobin-überexprimierenden Wurzeln erklären. Um die Wirkung der inneren Sauerstoffkonzentration auf die Wurzelatmung zu überprüfen, wurde die Respiration von Wildtyp- und Hämoglobin-überexprimierenden Wurzeln in einer 20-minütigen Zeitreihe mit VisiSens™ gemessen. Interessanterweise betrug die Respirationsrate von Hämoglobin-überexprimierenden Wurzeln 960 mmol/gfw/h (siehe auch Abb. 4), während in den Wildtyp-Wurzeln die Respirationsrate bei 730 mmol/gfw/h lag. Dies zeigt deutlich, dass Stickstoffmonoxid die Atmung hemmt und die Sauerstoff-Homöostase in den Wurzeln erhöht.
Zusammenfassung
Die Ergebnisse in diesen Experimenten stimmen mit früheren Ergebnissen bezüglich der NO-Produktion und ihrer hemmenden Wirkung auf die Pflanzenatmung überein. Mit dem VisiSens™ System war es möglich, Sauerstoffverteilungen in abgeschnittenen Wurzeln von Wildtyp und Hämoglobin-überexprimierender Gerste sichtbar zu machen. Das Sauerstoffbildgebungssystem erlaubte auch Atmungsmessungen. Die planaren Sensorfolien, die in jede gewünschte Form geschnitten werden können, ermöglichen es, das System in verschiedenen Aufbauten anzuwenden. Die Flexibilität und einfache Steuerung ermöglichen präzise Sauerstoffmessungen. Die Ergebnisse werden zum laufenden Projekt beitragen und weitere Einblicke in regulatorische Prozesse in Pflanzen geben.