Anaerobes intestinales Milieu und Sauerstoffkontrolle

Der Darm beherbergt ein kommensales Mikrobiom, das eine entscheidende Rolle für seine Physiologie und Funktionalität spielt. Einige der im Darm lebenden Mikroorganismen benötigen anaerobe Bedingungen, um zu überleben. [1] Für den Dünndarm wurde ein Sauerstoffgehalt von 4,1-4,5 % im Darmlumen angegeben. [5] Um diese anaerobe Darmumgebung und sauerstoffkontrollierte Bedingungen in vitro zu erreichen, sind daher im Allgemeinen spezielle Techniken und Geräte mit Inertgasen wie Stickstoff und Argon erforderlich.
Im Bereich der Mikrofluidik für Zellkulturen bestehen die meisten Plattformen für Intestine-on-a-Chip-Modelle aus PDMS (Polydimethylsiloxan). [2] PDMS ist jedoch sehr durchlässig für Gase und Wasserdampf und neigt außerdem dazu, lipophile Verbindungen unspezifisch zu adsorbieren. [3,4] Daher stellt die Verwendung neuer Materialien mit geringer oder gar keiner Gasdurchlässigkeit eine Alternative für die Simulation einer anaeroben Umgebung dar, indem die Sauerstoffkonzentration wirksam kontrolliert wird.
Beonchip verwendet zyklische Olefinpolymere (COP) für die Herstellung seiner Geräte. Dieses Material ist biokompatibel und hat einen Brechungsindex nahe dem von Glas. Darüber hinaus weist es eine sehr geringe Gasdurchlässigkeit auf, was eine präzise Steuerung der Gaskonzentration innerhalb der Geräte ermöglicht. Aufgrund dieser Eigenschaften sind die COP-Mikrofluidikgeräte ideal für die Nachbildung der Darmumgebung. Außerdem ermöglichen sie eine genaue Sauerstoffkontrolle.
Auf der Grundlage dieser Daten wollten wir eine physiologisch relevante anaerobe Darmumgebung in der Be-Doubleflow-Vorrichtung schaffen. Um dies zu erreichen, haben wir den Sauerstoffgehalt im Kulturmedium vor dem Eintritt und nach dem Austritt aus dem mikrofluidischen Kanal gemessen. Der Kanal enthielt eine intestinale Epithelschicht mit unterschiedlichen Flussraten.

Mikrofluidische Vorrichtung

Der Be-Doubleflow-Chip (Abb. 1) besteht aus zwei Flüssigkeitskanälen, die durch eine poröse Membran getrennt sind und den Austausch von Substanzen und Faktoren zwischen den Zelltypen in beiden Kompartimenten ermöglichen. Darüber hinaus sind diese Kanäle mit Gewindeein- und -auslässen versehen, die für den Anschluss an Perfusionssysteme vorgesehen sind und die Erneuerung des Kulturmediums gewährleisten. Folglich erzeugt das System Tangentialkräfte, die das Verhalten der Zellen direkt beeinflussen. Diese tangentialen Kräfte entstehen durch die Strömung und die Geschwindigkeit des Kulturmediums, das sich durch die Kanäle bewegt, und werden als Scherkräfte oder Scherspannung bezeichnet.

Mikrofluidischer Aufbau und Sauerstoffsensoren

Mikrofluidische Schaltungselemente

Eine Spritzenpumpe (Infusetek) führte das Kulturmedium in das Gerät ein und sorgte für einen kontinuierlichen Fluss. Während sich das Medium durch das System bewegt, übt es eine tangentiale mechanische Stimulation (Scherspannung) auf die Zelloberfläche aus und liefert gleichzeitig wichtige Nährstoffe und Gase. Darüber hinaus haben die verwendeten Schläuche (FEP/Tygon) und andere Komponenten des Systems eine sehr geringe Gasdurchlässigkeit. So wurde sichergestellt, dass die Sensormesswerte den Sauerstoffgehalt in der Flüssigkeit ohne Verluste im Kreislauf wiedergeben.
Zur Überwachung des Sauerstoffgehalts wurden sowohl am Einlass als auch am Auslass des Fluidiksystems Off-Chip-Sauerstoffsensoren (FTC-SU-PSt7-10-YOP-S) eingebaut. Zur Durchführung der Messungen wurde das Programm PreSens Measurement Studio 2 verwendet. Der PC ist mit dem OXY-4 ST Messgerät verbunden, das wiederum die optische Polymerfaser (POF-FTC-L2.5-1ST) mit dem Sauerstoffflusssensor im mikrofluidischen Kreislauf verbindet (Abb. 2).

Sauerstoffsensoren

Sauerstoff-Durchflusszellen (FTC-SU-PSt7-10-YOP-S) bieten die folgenden Vorteile:

• Sie dringen nicht in den Fluidikkanal für die Zellkultur ein. Sie ermöglichen daher einen einfachen Anschluss an externe Schläuche. Darüber hinaus ist dieses Design sowohl mit flexiblen als auch mit halbstarren Schläuchen kompatibel.
• Da sie steril und einwegfähig sind, ist kein Reinigungsprotokoll erforderlich.
• Sie ermöglichen die Gaskontrolle sowohl im oberen (epithelialen) als auch im unteren (endothelialen) Kanal.
• Darüber hinaus ermöglichen sie die Sauerstoffmessung sowohl am Einlass als auch am Auslass des Kanals, was eine Echtzeitüberwachung des zellulären Sauerstoffverbrauchs ermöglicht.

Vor dem Einsatz der Sensoren im System testeten wir eine Natriumsulfitlösung (sauerstofffrei), um Messwerte von 0 % sicherzustellen (Abb. 3).

Kontrolle der Kulturbedingungen für eine anaerobe Mikroumgebung

Zellkultur im Be-Doubleflow

Wir verwendeten Epithelzellen der immortalisierten kommerziellen Caco-2-Zelllinie in einem Co-Kultur-Verhältnis, das die Bedingungen im Dünndarm simuliert, mit HT29MTX-Zellen (modifiziert für die Schleimproduktion) im Kanal des Be-Doubleflow-Geräts (Abb. 1). Zunächst injizierten wir eine Kollagenbeschichtung in PBS (0,1 mg/mL) in den Kanal und inkubierten ihn 2 Stunden lang bei 37 °C. Vor der Aussaat wurde die Beschichtungslösung durch vollständiges Entleeren des Kanals vorsichtig entfernt. Anschließend wurde eine Suspension von einer Million Caco-2 + HT29MTX-Zellen (9:1) in 40 µl hochglukosehaltigem DMEM-Kulturmedium, das mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren ergänzt wurde, in den Mikrofluidikkanal eingebracht. Nach 4 Stunden statischer Inkubation bei 37 °C und 5 % CO₂ wurden weitere 300 µl Nährmedium zugegeben, um die Nährmediumreservoirs zu füllen. 24 Stunden lang wurde das Gerät dann (bei 37 °C und 5 % CO₂) auf einer Wippe bebrütet, so dass das Nährmedium durch die Schwerkraft automatisch erneuert wurde. Dieser sanfte Fluss ermöglicht die Bildung einer lebensfähigen zellulären Monoschicht. Nachdem wir die Bildung der zellulären Monoschicht mit Hilfe der optischen Mikroskopie bestätigt hatten, bauten wir das Gerät an eine Spritzenpumpe mit Anschlüssen, Schläuchen und Sauerstoffsensoren an. Schließlich ließen wir das Kulturmedium mit den zuvor festgelegten Durchflussraten durch das geschlossene System fließen. Wir haben alle 5 Minuten eine Sauerstoffmessung programmiert.

Mediumfluss und Scherspannung

Um die Sauerstoffkonzentration im Kulturmedium zu charakterisieren und die Flussrate entsprechend dem Sauerstoffverbrauch anzupassen, haben wir Be-Doubleflow mit verschiedenen Scherkräften beaufschlagt. In der Literatur wird berichtet, dass die auf das Darmepithel ausgeübten Scherkräfte zwischen 0,002 und 0,08 dyn/cm² liegen, wobei 0,02 dyn/cm² der von Forschern am häufigsten verwendete Wert ist. [6] Zu diesem Zweck haben wir die Formel 1 angewandt, in der die Durchflussrate oder -geschwindigkeit, die einer bestimmten Scherspannung in einem rechteckigen Kanal entspricht, unter Berücksichtigung der Höhe, der Breite und der Viskosität der Flüssigkeit berechnet wird.

Die Durchflussraten für 0,02 dyn/cm² und 0,01 dyn/cm² betragen also 5,6 bzw. 2,9 µL/min.

Sauerstoffverbrauch im Vergleich zur Durchflussrate

Die ersten Ergebnisse zeigten, dass nach 24 Stunden Kultur unter Flussbedingungen der Sauerstoffgehalt am Kanalausgang von anfänglichen Werten von 18-20 % auf 12-14 % bei 0,02 dyn/cm² sank. Andererseits sank der Sauerstoffgehalt bei 0,01 dyn/cm² nach 12 Stunden Perfusion auf 6 % (Abb. 4).

In Anbetracht der ersten Ergebnisse zeigte die Scherbelastung von 0,01 dyn/cm² Sauerstoffwerte, die näher an der anaeroben Darmumgebung für das Lumen und die Schleimhaut lagen (4,1-4,8 %). Daher behielten wir diese Bedingung drei Tage lang bei, um das Fortschreiten des Sauerstoffverbrauchs zu bewerten.
Abbildung 5 zeigt die ersten 8-12 Stunden, in denen der O₂-Anteil drastisch abnimmt, bevor er sich bei Werten zwischen 5 und 8 % stabilisiert.

Bei der Analyse der Werte über die Zeitintervalle stellten wir fest, dass der durchschnittliche Sauerstoffgehalt am Geräteausgang zwischen 8 und 24 Stunden bei 6,06 % lag. Im nächsten 24-Stunden-Zeitraum (24-48 Stunden) sank der Durchschnittswert leicht auf 5,97 %. Im letzten Zeitraum (48-72 Stunden) schließlich erreichte der durchschnittliche Sauerstoffgehalt 5,74 %.
Daraus lässt sich schließen, dass sich der Sauerstoffgehalt ab 8 Stunden nach Beginn der Kultur zwischen 5-6 % stabilisiert, während die Nährstoffe kontinuierlich erneuert werden. Dieser Aufbau ermöglicht die Schaffung einer anaeroben Darmumgebung, die die physiologischen Bedingungen im Be-Doubleflow genau nachahmt.

Integrität des Epithels und strukturelle Reifung

Die epitheliale Monolage blieb nach drei Tagen unter 0,01 dyn/cm² intakt (Abb. 6). Darüber hinaus wurde eine Zunahme der Höhe sowie die Bildung von dreidimensionalen Strukturen wie Kuppeln und Pseudovilli beobachtet, was auf eine epitheliale Reifung und Differenzierung hinweist.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Durchflussrate des Kulturmediums einen erheblichen Einfluss auf die Sauerstoffkonzentration hat, die von der Caco2+HT29MTX (9:1) Co-Kultur verbraucht wird. Eine Flussrate von 5,6 µL/min (0,02 dyn/cm²) führt zu einem Sauerstoffverbrauch von 6-10 % (im Vergleich zur Eingangskonzentration), was außerhalb der in der Literatur angegebenen Sauerstoffwerte liegt. Dies deutet darauf hin, dass höhere Flussraten möglicherweise nicht den typischen Sauerstoffverbrauch im Dünndarm widerspiegeln. Andererseits führt eine Flussrate von 2,9 µL/min (0,01 dyn/cm²) zu einem Sauerstoffverbrauch von 14-15 %. Dieser wiederum liegt im Durchschnitt bei 6 % Sauerstoff und entspricht damit genau den für den Dünndarm berichteten Werten. Niedrigere Durchflussraten simulieren also die physiologischen Bedingungen genauer. Daher bietet das mikrofluidische Be-Doubleflow-Gerät in Kombination mit den Sauerstoffsensoren von Presens eine effektive Plattform für die Untersuchung des Sauerstoffgehalts und die Schaffung einer anaeroben Darmumgebung in vitro.

Referenzen

[1] Ashammakhi, N. et al. Gut-on-a-chip: Current progress and future opportunities. Biomaterials 255, (2020).
[2] Jalili-Firoozinezhad, S. et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nat. Biomed. Eng. 3, 520–531 (2019).
[3] Kim, D. & Herr, A. E. Protein immobilization techniques for microfluidic assays. Biomicrofluidics 7, 1–47 (2013).
[4] Nam, G. et al. Water permeable flow of polydimethylsiloxane controlled by physicochemical treatment. JMST Adv. 1, 41–47 (2019).
[5] Keeley, T. P. & Mann, G. E. Defining physiological normoxia for improved translation of cell physiology to animal models and humans. Physiol. Rev. 99, 161–234 (2019).
[6] Chi, M. et al. A microfluidic cell culture device (μFCCD) to culture epithelial cells with physiological and morphological properties that mimic those of the human intestine. Biomed. Microdevices 17, 1–10 (2015).
[7] Poon, C. Measuring the density and viscosity of culture media for optimized computational fluid dynamics analysis of in vitro devices. bioRxiv 2020.08.25.266221 (2020) doi:10.1101/2020.08.25.266221.

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