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Auswirkungen von dCO2 auf Prozessparameter

Einfluss von hohem dCO2 auf die lebensfähige Zelldichte und den Produkttiter in CHO-Zellkultur

Jennifer Couture, Jennifer Lindsay, und Rick Baggio
EMD Millipore Corporation, Bedford, MA, USA

Die Überwachung von Bioprozessparametern in Echtzeit ist wichtig, um reproduzierbare Zellkulturen zu gewährleisten und die Produktqualität zu optimieren. Die schnelle Erkennung ungünstiger Bedingungen in der Zellkultur erfordert zuverlässige Sensorsysteme. CHO-Zellen - die einen Antikörper produzieren und sezernieren - wurden in Bioreaktoren kultiviert, und sowohl die lebensfähige Zellendichte als auch der Produkttiter wurden gemessen. Der Gehalt an gelöstem Kohlendioxid im Kulturmedium wurde mit einem optosensorischen CO2-Messsystem überwacht.

Zuverlässige Sensoren für die Inline-Messung von Prozessparametern auszuwählen, kann helfen, ungünstige Kulturbedingungen zu erkennen und zu kontrollieren. Kleine Änderungen in z. B. Sauerstoffzufuhr, pH-Wert oder CO2 im Kulturmedium können zu unerwarteten Veränderungen des Zellmetabolismus und der Lebensfähigkeit führen, und den Produktionsertrag minimieren. Im folgenden Test wurden die lebensfähige Zelldichte, der Produkttiter und dCO2 in CHO-Zellkultur überwacht. Der faseroptische CO2-Transmitter pCO2 mini der PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, wurde mit Hilfe von chemisch-optischen Sensoren zur Überwachung von dCO2 in  Bioreaktoren eingesetzt. Mit diesem System konnte gezeigt werden, dass ein hoher dCO2-Gehalt im Kulturmedium eine Wachstumsverzögerung verursachen kann.

CHO-Kultivierung

Die CHO-Zellen, die in diesen Experimenten verwendet wurden, produzierten und sezernierten eine intern humanisierte Variante des monoklonalen Anti-Phosphotyrosin-Antikörper-4G10®-Klons (Merck Millipore). Die Zellen wurden in Applikon® ez-Control (Applikon Biotechnology Ltd., Dover, NJ) Bioreaktoren mit 3 l und einem Arbeitsvolumen von 2 l kultiviert. Als Medium für die Bioreaktoren verwendeten wir Gibco® OptiCHO™ medium (Life Technologies Inc., Carlsbad, CA). Die lebensfähige Zelldichte (VCD) wurde offline durch ein Trypanblau-Ausschlussassay an einem Vi-Cell® Cell Viability Analyzer (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA) gemessen. Zeitlich zugeordnete Proben wurden unmittelbar nach der Extraktion aus den Bioreaktoren, im Durchschnitt 2 bis 3 mal täglich, analysiert. Der Produkttiter wurde mit einem halbautomatischen Gelelektrophorese-Instrument P200 ScreenTape® System (Lab 901 Limited, Loanhead, UK) bestimmt. Die Proben für den Bioreaktor Lauf I und II wurden unter nicht-reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Reagenzien und Empfehlungen von Lab901 vorbereitet. Vorkalibrierte CO2 Sensor Spots (PreSens) wurden mit Kwik-Sil Silikon (WPI Inc., Sarasota, FL) auf das Ende eines 12 mm-Polycarbonatstabs aufgeklebt, der in ein 12 mm-Standard-Applikon-Kompressionsfitting passte. Das pCO2 mini (Abb. 1) wurde verwendet, um Veränderungen des dCO2 in den Medien während des gesamten Bioreaktorlaufs mit Abtastintervallen von 30 Sekunden zu überwachen.

Auswirkung des dCO2 auf die Zellkultur

In den folgenden Testläufen zeigten Bioreaktorläufe I und II, aufgrund von Kalibrierungsproblemen mit der elektrochemischen pH-Sonde im Bioreaktor II, während der ersten 48 Stunden einen wesentlichen Unterschied im gelösten Kohlendioxidgehalt. Die Steuerung für den Bioreaktor II kompensierte die fehlerhaften pH-Werte durch Erhöhung des gelösten Kohlendioxidgehaltes. Gegen Ende des ersten Tages hatte sich der Unterschied in dCO2-Prozent zwischen Bioreaktor II und I verdreifacht. Der hohe dCO2-Wert hatte sowohl auf die lebensfähige Zelldichte (VCD) als auch den Produkttiter negativen Einfluss. Obwohl beide Bioreaktoren mit ähnlichen anfänglichen Zelldichten besiedelt worden waren, wurde eine wesentliche Wachstumsverzögerung für Bioreaktor II im Vergleich zu Bioreaktor I sowohl für VCD (Abb. 2) als auch Produkttiter (Abb. 3) beobachtet.

Zusammenfassung

Die Überwachung von dCO2 kann nützlich sein, um die Ursache für unerwartete Trends in der Zelllebensfähigkeit und dem Produkttiter während eines Bioreaktorlaufs zu ermitteln. Es wurde gezeigt, dass protokollierte dCO2-Daten hilfreich sind, um die Leistung nachfolgender Bioreaktorläufe zu verbessern, indem Prozessparameter angepasst und zuverlässige Inline-Prozesssensoren ausgewählt werden.

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