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Zellkulturüberwachung im Rührkessel-Bioreaktor mit optischen pH-Sensoren

Neuartige pH-Sonde und pH Sensor Spots für die Langzeitzellkultur

Melissa Hill1, Greg Laslo1, Marcelo Kern1, Sayantan Bose1, Christian Krause2
1
GlaxoSmithKline, King of Prussia, PA, USA
2PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Deutschland

Wir verwendeten neuartige autoklavierbare optische Sensor Spots von PreSens sowie eine neuartige pH-Sonde für die Online-Überwachung von Zellkulturen. Optische Messungen wurden mit Referenzdaten von Mettler-Toledo-Sonden verglichen. In der ersten experimentellen Phase untersuchten wir die an den Bioreaktorwänden angebrachten pH Sensor Spots auf Signalstabilität, Spot-zu-Spot-Variabilität und Drift. Die Spots tendierten mit den Referenzmessungen und zeigten nur eine minimale Drift über die Zeit. Die zweite experimentelle Phase konzentrierte sich auf die Bewertung der pH-Sonde, die enbenfalls gut mit Messungen der Mettler-Toledo-Sonde übereinstimmte.

Die Überwachung und Kontrolle wichtiger Kulturparameter wie DO und pH ist eine Voraussetzung für die Zellkultur von Säugetieren. Ungünstige Bedingungen können das Wachstum beeinträchtigen oder sogar ein Kulturversagen verursachen. Daher werden präzise und langzeitstabile Sensoren benötigt, die in Bioreaktoren implementiert werden können.
Optische Sensoren können in vielen verschiedenen Sensordesigns und -größen hergestellt werden und bieten daher mehr Flexibilität bei der Integration in das Kulturgefäß. Während Standard-12-mm-Edelstahlsonden durch einen dafür vorgesehenen Anschluss in den Bioreaktor eingeführt werden müssen, sind optische Sensor Spots vergleichsweise viel kleiner und können sogar in Bioreaktoren ohne Sondenanschlüsse eingesetzt werden. Darüber hinaus ermöglichen die Spots die nicht-invasive Messung durch die Gefäßwand, wodurch das Kontaminationsrisiko erheblich verringert wird. Während optische pH Sensor Spots für die Verwendung in autoklavierbaren Glasbioreaktoren geeignet sind, kann die Edelstahlsonde auch in autoklavierbaren Stahlfermentern eingesetzt werden. In dieser Studie untersuchten wir zwei verschiedene optische pH-Sensordesigns für die Zellkulturüberwachung in einem Rührkessel-Bioreaktor. Vier pH Sensor Spots vom Typ LG1 wurden an der inneren Bioreaktorwand angebracht. Einer der Spots wurde für kontinuierliche Messungen verwendet, während die anderen drei Spots täglich überprüft wurden, um die Variabilität von Spot zu Spot zu bestimmen. Die neue PreSens pH-Edelstahlsonde mit einem Durchmesser von 12 mm wurde durch eine Standardöffnung in den Bioreaktor eingeführt. Gleichzeitig wurden in diesen Experimenten optische O2 Sensor Spots und eine O2-Sonde von PreSens ausgewertet, und die Ergebnisse werden in einem separaten Applikationsbericht beschrieben. In zukünftigen Experimenten wird auch die Anwendbarkeit dieser Sensoren zusammen mit einem Controler getestet.

Material & Methoden

Die optischen pH Sensor Spots (SP-LG1) wurden an der Innenwand eines 3 l Glasbioreaktors angebracht. In den Wärmemantel des Bioreaktors wurde ein Loch geschnitten, damit die Sensor Spots von außen über eine optische Polymerfaser ausgelesen werden konnten. Der Reaktor mit den montierten optischen Sensoren wurde autoklaviert. Die Sensor Spots wurden unmittelbar vor der Inokulation mit einer CHO-Zelllinie einpunktkalibriert. Der pH-Wert des Bioreaktors wurde mit dem Applikon EZ Controller mit einem Sollwert von 7,00 ± 0,05 geregelt.
Ein Adapter für runde Behälter (ARC) wurde verwendet, um die Lichtleitfasern an der Außenseite des Glases gegenüber der Sensor Spots zum kontinuierlichen Auslesen in Position zu halten. Die anderen Sensoren wurden für regelmäßige Überprüfungen verwendet, um die Variabilität von Spot zu Spot und die Auswirkungen des Photobleichens über einen Zeitraum von 15 Tagen zu bestimmen. Die Sensor Spots wurden mit pH-1 SMA LG1 Messgeräten verbunden und die Messungen mit der PreSens Measurement Studio 2 Software gesteuert. Die optische Edelstahlsonde wurde über eine Standardöffnung im Deckel in den Bioreaktor eingeführt (Abb. 1). Kontinuierliche Messungen wurden in Intervallen von 5 Sekunden durchgeführt.

Ergebnisse

Abbildung 2 zeigt PreSens pH-Messungen und Referenzdaten für einen 15-tägigen Überwachungszeitraum in Zellkultur. Für diese Studie wurde unmittelbar vor der Inokulation eine Einpunktanpassung für die PreSens-Spots vorgenommen. Für den Rest der Studie wurde die Mettler-Toledo-Sonde, die das System kontrollierte, probenkorrigiert, aber die PreSens- Spots und die zweite Mettler-Toledo-Sonde wurden nicht erneut probenkorrigiert. Das Experiment sollte die Leistung des optischen Sensors und eine mögliche Drift bestimmen. Die optischen pH-Werte stimmten gut mit den Daten der Referenzsonden überein, und zeigten ab Tag 11 nur eine geringe Drift (Abb. 3). Peaks, die während des gesamten Experiments in den PreSens Messungen beobachtet wurden, traten während der täglichen Ablesungen der manuell überwachten Spots auf.

Einmal täglich während der Offline-Probenahme wurde das Glasfaserkabel manuell zwischen den drei nicht kontinuierlich messenden Spots bewegt, um die Variabilität und Drift von Spot zu Spot zu testen. Abbildung 3 zeigt, dass die 4 Spots unterschiedlich stark abweichen. Spot 1 war der kontinuierlich messende Sensor. Spot 2 war im ausgeschnittenen Heizmantelfenster platziert, wodurch er während der gesamten Studie Licht ausgesetzt werden konnte. Die Spots 3 und 4 befanden sich hinter dem Heizmantel und waren nur begrenzter Belichtung ausgesetzt. Nach 10 Tagen driftete der kontinuierlich messende Spot um etwa 0,1 pH-Einheiten und bis zum 15. Tag um 0,2 pH-Einheiten. Der lichtexponierte Spot (Spot 2) driftete um 0,3 pH-Einheiten, was mehr als bei allen anderen Spots war. Die beiden Spots, die nur wenig Licht ausgesetzt waren, und die zweite Mettler-Toledo-Sonde drifteten minimal. Diese Daten zeigen, dass die pH Spots besonders empfindlich gegenüber konstanter Belichtung sind.

Im folgenden Experiment wurden ein pH Sensor Spot sowie ein Prototyp einer pH-Sonde von PreSens zur Überwachung verwendet und mit der kontrollierenden Mettler-Toledo-Sonde verglichen (Abb. 4). Der PreSens pH Spots und die Sonde sowie die Mettler-Toledo-Sonde wurden einmal täglich einpunktkalibriert. Sowohl der Sensor Spot als auch die Stahlsonde enstprachen in etwa den Referenzmessungen. Die pH-Sonde zeigte mehr Signalrauschen, der Grund kann eine höhere Empfindlichkeit gegenüber Luftblasen sein.

Zusammenfassung

Unsere Auswertung von autoklavierbaren optischen pH Sensor Spots und dem Prototyp einer Edelstahlsonde ergab, dass diese Sensoren für die pH-Überwachung in Säugetierzellkulturen geeignet sind. Die nicht-invasiven Sensor Spots bieten mehrere Vorteile, wenn die Anzahl der Sondenanschlüsse begrenzt ist. Es können mehrere Spots an verschiedenen Positionen im Bioreaktor integriert werden, die zusätzliche Informationen zu Mischeffekten liefern können. Die Sensoren zeigten nur eine minimale zeitliche Drift und stimmten gut mit den Referenzsonden überein. Die PreSens Sensoren weisen jedoch Signalrauschen und Lichtempfindlichkeit auf. In der nächsten Phase unserer Studie wird die optische pH-Sonde an die Steuerung angeschlossen und das Signal zur Steuerung des Kultur-pH verwendet.

Danksagung
Das zu diesem Bericht führende Projekt wurde von der gemeinsamen Initiative Innovative Medicines Initiative 2 im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 777397 finanziert. Dieses gemeinsame Unterfangen erhält die Unterstützung des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union und EFPIA.

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