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Charakterisierung von CHO-Zelllinien mit SFR vario
Was Ihnen Online-Messdaten über Ihre Zellkultur sagen können
R. W. Maschke1, B. Pretzner2, G. T. John3, D. Eibl1
1Zürcher Hochschule für Angewandte Wissenschaften, Institut für Chemie und Biotechnologie, Wädenswil, Schweiz
2Werum IT Solutions GmbH, Wien, Österreich
3PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Deutschland
Es gibt zahlreiche CHO-Zelllinien mit unterschiedlichen Eigenschaften. Sie müssen vor Beginn eines Produktionsprozesses charakterisiert werden, um sicherzustellen, dass die Zellen für die geplante Anwendung geeignet sind. Das SFR vario ist eine Multiparameter-Überwachungsplattform für die Schüttelkolbenkultur und liefert Online-Daten für Sauerstoff, pH und Biomasse. In diesem Bericht geben wir einige Beispiele dafür, wie dieses Online-Überwachungsgerät verwendet werden kann, um Vorkulturen von CHO-Zelllinien zu charakterisieren, bevor ein Bioreaktorlauf gestartet wird.
CHO-Zellen können leicht in Suspensionskultur gezüchtet werden und werden daher häufig in der Forschung oder für Proteinproduktionsprozesse verwendet. Seit der Etablierung der ursprünglichen CHO-Zelllinie im Jahr 1956 wurden viele Varianten der Zelllinie entwickelt [1].
Vorkulturen im Schüttelkolbenmaßstab werden oft nicht überwacht und die Wachstumsrate muss in Offline-Messungen bestimmt werden. Um die CHO-Zelllinien in unserem Labor zu charakterisieren, bevor größere Produktionsprozesse gestartet wurden, verwendeten wir die Online-Überwachungsplattform SFR vario zur Bestimmung des Zellwachstums und für Inokulumtests im Schüttelkolbenmaßstab. Darüber hinaus ermöglicht SFR vario die Online-Bestimmung der Biomasseentwicklung über Streulichtmessungen, und wir haben diese Messmethode auch für die CHO-Zellkultur evaluiert.
Material & Methoden
Die CHO DP-12 Zellen (Klon 1934, bereitgestellt von Prof. Noll, Bielefeld) wurden in TC42-Medium (Xell AG) gezüchtet, die Lebendzelldichte bei Inokulation betrug 0.3 x 106 Zellen ml-1. Die Kultivierungen wurden in 250 ml Schüttelkolben ohne Schikanen mit 80% Arbeitsvolumen durchgeführt. Die Inkubationsbedingungen waren 37 ° C, 7,5 % CO2 und 80 % relativer Luftfeuchtigkeit, bei 120 U / min und 50 mm Schüttelhub. Der Messwinkel für Biomassemessungen mit dem SFR vario wurde nicht angepasst. Die Datenerfassung und -auswertung erfolgte mit inCyght von Werum IT Solutions.
Bestimmung der Wachstumsrate mit Online-Daten
Abb. 2A zeigt die Wachstumsrate einer CHO DP-12-Zellkultur, die mit herkömmlichen Offline-Messungen bestimmt wurde. Alle 24 Stunden wurden Proben für eine Analyse der lebensfähigen und gesamten Zelldichte entnommen. Ein exponentieller Fit kann angewendet werden, um die maximale Wachstumsrate zu bestimmen:
wobei cx(t) die lebensfähige Zelldichte zum Zeitpunkt t, cx0 die anfängliche lebensfähige Zelldichte und µmax die maximale Wachstumsrate ist. Mit Offline-Daten wurde eine maximale Wachstumsrate von µmax = 0,0326 h-1 für die CHO-Zellkultur bestimmt.
In 2B sind online aufgezeichnete SFR vario Daten für die Sauerstoffaufnahmerate (OUR) aufgetragen. Wiederum kann ein exponentieller Fit angewendet werden, was eine ähnliche Wachstumsrate von 0,0320 h-1 ergibt. Online OUR-Daten können verwendet werden, um die CHO-Wachstumsrate zu bestimmen, ohne tägliche Probenahmen und Offline-Analysen durchführen zu müssen.
CHO Batch-Vergleich
Abb. 3 zeigt die lebensfähige Zelldichte und online gemessene pH-Daten in zwei Chargen von CHO-Zellkultur. Während die Zellen wachsen, produzieren sie Laktat und der pH-Wert im Kulturmedium nimmt ab. Nach ca. 125 h kommt es zu einer Stoffwechselverschiebung und die pH-Werte beginnen wieder anzusteigen. Wenn diese Verschiebung nicht auftritt, ist die maximal erreichbare Zelldichte und finale Produktkonzentration geringer, als dies bei einem optimalen Kulturverlauf der Fall wäre [2]. Wir verwenden die Online-pH-Daten für Chargenvergleiche und Inokulumtests, um festzustellen, ob die CHO-Zellen für einen weiteren Bioreaktorlauf geeignet sind. Auf diese Weise hilft das SFR vario, die Vorkulturen zu bewerten, die Reproduzierbarkeit zu verbessern und Zeit- und Ressourcenverschwendung bei Bioreaktorläufen mit geringerer Leistung zu vermeiden.
Streulichtmessungen
Abb. 4 zeigt online und offline bestimmte Prozessdaten von CHO DP-12 Zellkultur in einem Schüttelkolben ohne Schikanen. Die ungeglätteten Streulichtmessungen (graue Linie) zeigen das starke Signalrauschen bei niedrigen Zelldichten. Mit zunehmender Zelldichte nimmt das Signal-Rausch-Verhältnis ab. Während offline bestimmte lebensfähige und tote Zelldichten sowie die Online-Sauerstoffmessungen anzeigen, dass nach etwa 300 h Kultivierung die Sterbephase beginnt, zeigt sich im Streulichtsignal ein steiler Anstieg. Dies wird wahrscheinlich durch die veränderte Zelloberfläche der toten Zellen verursacht. Die Messungen des rückgestreuten Lichts korrelieren mit der Dichte der toten Zellen und könnten daher als Indikator für die Lebensfähigkeit verwendet werden.
Zusammenfassung
Die mit dem SFR vario gesammelten Online-Daten können auf verschiedene Arten zur Analyse und Charakterisierung von CHO-Zelllinien verwendet werden. Während die Sauerstoffaufnahmerate verwendet werden kann, um Wachstumsraten zu bestimmen, kann die pH-Kurve verwendet werden, um Chargen zu vergleichen und ein geeignetes Inokulum für die Kultivierung in größerem Maßstab auszuwählen. Das Online-Biomassesignal könnte als Indikator für die Lebensfähigkeit verwendet werden. Das SFR vario bietet nicht nur einen tieferen Einblick in kritische Prozessparameter und trägt zur Gewährleistung der Reproduzierbarkeit von CHO-Kultivierungen bei, sondern reduziert auch die Arbeitszeit für Schüttelkolben-Batch-Kultivierungen, da Offline-Sampling und -Analysen nicht mehr erforderlich sind.
Referenz
[1] Wurm FM; Hacker D (2011). "First CHO genome". Nature Biotechnology. 29 (8): 718–20. doi:10.1038/nbt.1943. PMID 21822249
[2] Freund, N.W.; Croughan, M.S. A Simple Method to Reduce both Lactic Acid and Ammonium Production in Industrial Animal Cell Culture. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 385.
Dieses Projekt wurde von der Europäischen Union im Rahmen des EuroStars-Rahmens (Projekt-ID 11 795) finanziert.