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Interpretation von SFR vario Online-Daten aus Pflanzenzellsuspensionskultur
Charakterisierung von Pflanzenzelllinien für erfolgreiche Produktionsprozesse
R. W. Maschke1, B. Pretzner2, G. T. John3, D. Eibl1
1Zürcher Hochschule für Angewandte Wissenschaften, Institut für Chemie und Biotechnologie, Wädenswil, Schweiz
2Werum IT Solutions GmbH, Wien, Österreich
3PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Deutschland
Wir verwendeten das SFR vario zur Online-Überwachung in Pflanzenzellsuspensionskulturen im Schüttelkolbenmaßstab. Durch den Vergleich der online gesammelten Daten mit offline ermittelten Werten konnten wir bestätigen, dass die SFR vario Streulichtmessung eine gute Vorhersage der Biomasseentwicklung ermöglicht. Darüber hinaus gaben die Online-pH- und Sauerstoffmessungen Einblicke in verschiedene Stoffwechselprozesse während der gesamten Kultivierungsdauer.
Die Bewertung von Zelllinien oder die Kulturoptimierung für biopharmazeutische Produktionsprozesse wird häufig in kleinen Systemen wie Schüttelkolben durchgeführt. Pflanzenzellsuspensionskulturen können jedoch zu hohen Zellvolumina wachsen, was zu einer zunehmenden Viskosität und Problemen beim Mischen und Sauerstofftransfer im Kulturgefäß führt. Daher ist es wichtig, Schlüsselkulturparameter zu überwachen, um eine sichere Produktion und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
Wir haben die SFR vario Überwachungseinheit verwendet, um Sauerstoff, pH und Biomasse in Vitis vinifera cv Uva Italia Zellsuspensionskultur zu messen. Wir bewerteten die Methode der Streulichtmessung zur Bestimmung der Biomasse und wie kontinuierliche Online-Messungen interpretiert und zur Kulturbewertung im Schüttelkolbenmaßstab verwendet werden können.
Material & Methoden
Die Suspensionszellkultur von V. vinifera [1] in Murashige und Skoog Medium mit 30 gL-1 Saccharose wurde in 250 ml oder 500 ml Schüttelkolben (40% Füllvolumen, 120 U / min, 50 mm Schüttelamplitude) bei 26 ° C durchgeführt. Das SFR vario wurde für kontinuierliche Messungen von O2, pH und Streulicht (Biomasse) verwendet. Der Messwinkel für Biomassemessungen wurde nicht angepasst. Fruktose-, Glukose- und Saccharosekonzentrationen wurden mittels HPLC bestimmt und zur Gesamtzuckerkonzentration zusammengerechnet. Das gepackte Zellvolumen (PCV), das Zelltrockengewicht und das Zellfrischgewicht wurden offline für den Vergleich mit den Online-Daten bestimmt. Die Datenerfassung und -auswertung erfolgte mit dem Datenanalyse-Management-System inCyght von Werum IT Solutions.
Online- und Offline-Messungen in Pflanzenzellsuspensionskulturen
In Abb. 2 ist eine online aufgezeichnete Streulichtmessung im Vergleich zu offline gesammelten Biomassedaten in einer V. vinifera Zellsuspensionskultur aufgetragen. Streulichtmessungen zeigen einen kontinuierlichen Anstieg der Biomasse, der nach 10 Tagen ein Maximum erreicht. Der gleiche Trend der Biomasseentwicklung ist in den Offline-Daten zu sehen. Nach 10 Tagen Kultivierung zeigen die Online-Daten auch ein Prozessereignis, das bei den Offline-Messungen nicht erkannt werden konnte. Online gesammelte pH- und Sauerstoffdaten geben weitere Informationen zu Prozessereignissen (siehe Abb. 3).
Die Änderung des pH-Werts zeigt die Aufnahme verschiedener Stickstoffspezies an (die Aufnahme von Ammonium führt zu einer Abnahme des pH-Werts, und bei niedrigem pH-Wert wird die Aufnahme von Nitrat bevorzugt, was zu einer anschließenden Erhöhung des pH-Werts führt [2]). Dies ist typisch für eine Pflanzenzellsuspensionskultur und ein guter Indikator dafür, dass die Kultur gut wächst. Der schwankende Verlauf der Messungen von gelöstem Sauerstoff zeigt den sukzessiven Verbrauch verschiedener Kohlenstoffquellen an (blaue Pfeile in Abb. 3). Die vollständige Erschöpfung der Kohlenstoffquellen zeigt sich in einem starken Abfall des Sauerstoffgehalts nach 10 Tagen Kultivierung. Gleichzeitig zeigen die Streulichtmessungen, dass die maximale Biomasse erreicht ist.
Das Streulichtsignal kann kalibriert werden, um den Biomassewert in z. B. OD600 oder Zelltrockengewicht anzuzeigen. Abb. 4A zeigt eine Kultivierung in einem 500 ml Kolben, bei der nach 5 Tagen frisches Medium zugegeben wurde. Das Streulichtsignal wurde mit Daten, die in einem 250 ml Kolben gewonnen wurden, kalibriert und zeigt das online gemessene Zelltrockengewicht, das wir mit offline gemessenem Zelltrockengewicht und Zellfrischgewicht verglichen haben. Die Korrelation (Abb. 4B) zeigt, dass das kalibrierte Online-Signal eine ideale Vorhersage des tatsächlichen Zelltrockengewichts liefert (R2 = 0.983).
Zusammenfassung
Unsere Bewertung des SFR vario Überwachungssystems ergab, dass die Bestimmung der optischen Biomasse über Streulichtmessungen gute Ergebnisse in der Pflanzenzellsuspensionskultur liefert. Darüber hinaus geben die mit SFR vario gemessenen kombinierten Sauerstoff-, pH- und Biomassedaten Aufschluss über Stoffwechselereignisse, die mit Offline-Messungen nicht erfasst werden können. Die von SFR vario bereitgestellten Echtzeitinformationen ermöglichen es uns, den ordnungsgemäßen Kulturverlauf frühzeitig während des Prozesses zu überprüfen, und liefern genaue Daten über das Zellwachstum.
Referenz
[1] Cuperus, F. S.: Influence of UV-B radiation on quality determing compounds in must and wine and suspension cell cultures of Vitis vinifera, ETH Zürich, phdthesis, 2007. http://dx.doi.org/10.3929/ethz-a-005347787. – DOI 10.3929/ethz–a–005347787<br /> [2] E. F. George and G.-J. Klerk, “The components of Plant Tissue Culture Media I: Macro- and Micronutrients”, Plant Propagation by Tissue Culture, 3rd Edition, 2008
Dieses Projekt wurde von der Europäischen Union im Rahmen des EuroStars-Rahmens (Projekt-ID 11 795) finanziert.