Co-Kulturen von Caco-2 und E.coli

Optosensorische Online-Überwachung der O₂-Aufnahme und der extrazellulären Versauerung

Oligogalacturonsäuren (OGAs), die durch Hydrolyse von Pektin hergestellt werden, hemmen bekanntermaßen die Adhäsion von pathogenen Bakterien an Darmzellen und verhindern somit Infektionskrankheiten. Um die Wirkungen von OGAs zu testen, wurde ein in vitro Modell bestehend aus Caco-2 Zellen (humaner Dünndarm) und dem E. coli C25-Stamm erstellt. Die Co-Kulturen wurden in einer neuen, markerfreien Zell-Assay-Plattform eingerichtet, die mit einer 24 Well Platte arbeitete. Der SDR SensorDish® Reader ermöglicht die kinetische Überwachung von Sauerstoff und pH-Wert in jedem Well mit chemisch-optischen Sensoren, um so die zelluläre Sauerstoffaufnahme und die extrazelluläre Ansäuerung zu analysieren.

Das Gerät besteht aus einem Pipettierroboter, einer Klimabox und Sensorsystemen. Der Roboter versorgt die in Testplatten mit 24 Wells kultivierten Zellen mit Medien und Wirkstoffen (Abb. 1). Die Klimabox sorgt bei Langzeitmessungen für konstante Temperatur, Luftfeuchtigkeit und aseptische Bedingungen. Chemisch-optische Sensoren für gelösten Sauerstoff und pH (PreSens GmbH) werden mit dem SDR SensorDish® Reader (PreSens GmbH) unter der Testplatte für beide Parameter angeregt und ausgelesen. Die Sensoren werden als kleine Punkte auf das Glassubstrat, das den Boden der Platte bildet, aufgebracht. Die Auslesefrequenz jedes Sensors liegt bei 0,16 Hz. Mit Hilfe des Deckel wurden kleine Volumina von ca. 20 μl (Kammerhöhe ca. 0,5 mm) in jedem Well angepasst, um beim Abstellen des Flusses (ca. 10 min.) einen schnellen Sauerstoff- und pH-Abfall zu erreichen. Im folgenden Durchflusszyklus wurde das Medium innerhalb des Mikrovolumens (teilweise) vom Roboter ausgetauscht, um die Grundwerte wiederherzustellen. In Zeitintervallen von 2 Stunden wurde das Medium in den Vertiefungen vollständig ausgetauscht. Die Raten des zellulären Sauerstoffverbrauchs und der extrazellulären Ansäuerung innerhalb der Mikrovolumina wurden aus den Steigungen während der Zeitintervalle ohne Strömung berechnet, d.h. (Δ%O₂ / Δt) und (ΔpH / Δt). Die Rohdatenauswertung (und Systementwicklung) wurde durch Prozesssimulation mit Finite-Elemente- (FEM-) numerischer Simulation unterstützt, die die molekulare Diffusion, die Pufferkapazität (Abb. 2) und den Flüssigkeitsstrom beschrieb.

Die Arbeitshypothese hinter dieser Arbeit war, (1) dass E. coli C25 bei Adhäsion nachweisbare Wirkungen auf den Caco-2 Metabolismus hat und (2) dass solche Effekte durch Zugabe von OGAs inhibiert werden können. Um diese Hypothesen zu testen, wurden Caco-2 Zellen auf der Testplatte ausgesät und für 14 Tage kultiviert, um eine gut differenzierte Schicht von Darmzellen zu erhalten. Dann wurde die Platte in die Systemplattform eingesetzt und die Messung von pH und Sauerstoff wurde gestartet. Nach 2 Stunden wurden E. coli C25 in das Vorratsgefäß gegeben, das das Medium enthielt, für 1 Stunde inkubiert und durch den Pipettierroboter wieder ausgewaschen. Die hinzugefügten Bakterien waren entweder mit oder ohne OGA (Fraktion V 12.1) vorinkubiert worden. Nach dem Auswaschen der Bakterien im Überstand wurde dem Medium Ampicillin zugegeben, um ein unkontrolliertes Wachstum von verbleibenden anhaftenden Bakterien zu verhindern. Die Datenerfassung dauerte 22 Stunden. Abb. 3 zeigt die Kinetik nach Umstellung von Standardmedium für die Zellkultivierung auf 3 verschiedene Medien - Zellkulturmedium für die Caco-2 Zellen (Kontrolle), Medium mit E.coli und Medium mit E.coli und OGAs - aber noch vor dem Auswaschen von Bakterien aus dem Überstand. Der Vergleich von Proben von E.coli mit und ohne OGAs zeigt, dass OGAs - abgesehen von einer erwarteten Wirkung auf die Adhäsion - eine deutliche wachstumshemmende / zytotoxische Wirkung auf Bakterien haben. Obwohl in diesem Stadium des Tests die gleiche Menge an E. coli in beiden Medien vorhanden war, zeigten die OGA-enthaltenden Proben eine viel geringere Aktivität als die Proben mit nur E. coli. Beim Vergleich der pH-Kinetik zeigten die Proben mit OGA nur eine etwas höhere Aktivität im Vergleich zur Kontrolle ohne Bakterien (angezeigt durch die abnehmenden Verschiebungen bei Mediumwechsel). Neuere Ergebnisse legen nahe, dass verschiedene Fraktionen von OGAs, die durch Pektinhydrolyse hergestellt wurden, sich in ihren adhäsions- und wachstumshemmenden Wirkungen deutlich unterscheiden. Im Gegensatz zur Arbeitshypothese zeigte sich jedoch, dass die Co-Kultivierung von E. coli C25 und Caco-2 Zellen keine offensichtlichen Auswirkungen auf den Caco-2 Metabolismus hat. Abbildung 4 zeigt die gesamte Kinetik des Assays. Nach dem Auswaschen der Bakterien aus dem Überstand nach 4 Stunden unterschieden sich die Ansäuerungsraten der 3 unterschiedlich behandelten Proben nicht wesentlich. Die statistische Auswertung der Daten aller Wells (8 Vertiefungen für jede der drei Gruppen mit (1) Caco-2 Zellen alleine, (2) Caco-2 + E. coli C25 und (3) Caco-2 + E. coli C25 / OGA ) bestätigt das Fehlen nachweisbarer Effekte auf den Caco-2 Metabolismus, der mit der Adhäsion von E. coli korreliert sein könnte. Die Adhäsion von E. coli C25 an Caco-2 Zellen selbst wurde unabhängig verifiziert, indem koloniebildende Einheiten aus adhärenten Zellen gezählt wurden (Daten nicht gezeigt). Offensichtlich beinhaltet der pathogene Mechanismus keine ausgeprägten metabolischen Reaktionen der betroffenen Caco-2 Zellen. Die Studie konzentriert sich nun auf die Quantifizierung von wachstumshemmenden / toxischen Wirkungen der verschiedenen OGA-Fraktionen allein auf Bakterienstämme.