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Erweiterte Respirometrie mit chemisch-optischen Sensorspots
Nicht-invasives Tracking von Sauerstoff, Kohlendioxid und pH als Indikator für die Nitrifikationsaktivität
Eva M. Gilbert, Susanne Lackner
Karlsruher Institut für Technologie (KIT), Engler-Bunte Institute, Wasserchemie und Wassertechnologie, Karlsruhe, Deutschland
Die Respirometrie ist eine indirekte Methode zur Messung der mikrobiellen Aktivität, beispielsweise der Nitrifikation. Die Sauerstoffaufnahme ist proportional zum Substratverbrauch - gegeben durch die Stöchiometrie des Prozesses. Kombiniert man die Sauerstoffaufnahme mit der Freisetzung (heterotroph) oder Aufnahme (autotroph) von Kohlendioxid und pH-Änderungen erweitert sich die Anwendbarkeit dieser Respirometrie-Assays. Die Messung kombinierter Prozesse wird möglich, da pH-Wert und Kohlendioxid-Tracking die anteilige Zuordnung der Sauerstoffaufnahme zu verschiedenen Prozessen ermöglicht, wie in diesem Experiment für die autotrophe Nitrifikation veranschaulicht wird.
Nitrifikation ist ein Schlüsselprozess im natürlichen Stickstoffkreislauf und wird in der biologischen Abwasserreinigung eingesetzt. Sie beschreibt zwei aufeinanderfolgende biochemische Reaktionen, die von verschiedenen Bakteriengruppen durchgeführt werden: Der erste Schritt ist die Oxidation von NH4+ zu NO2- (siehe Gl. 1), die sogenannte Nitritation, die von ammoniumoxidierenden Bakterien (AOB) durchgeführt wird. Die Umwandlung jedes Mols NH4+ erfordert 1,5 Mol O2 und setzt zusätzlich zwei Wasserstoffionen frei, was den pH-Wert senkt. Die weitere Oxidation von NO2- zu NO3- (siehe Gl. 2), die sogenannte Nitratation, die von nitritoxidierenden Bakterien (NOB) durchgeführt wird, benötigt nur 0,5 Mol O2 pro Mol NO2- und der pH-Wert ändert sich nicht.
NH4+ + 1.5 O2 -> NO2- + H2O + 2 H+ (Eq. 1)
NO2- + 0.5 O2 -> NO3- (Eq. 2)
Beide Prozesse werden von autotrophen Bakterien durchgeführt; das sind Bakterien, die keinen organischen Kohlenstoff benötigen - sie nutzen CO2 als Kohlenstoffquelle für ihre Zellstruktur. In solchen Systemen ist es wichtig, die Konzentrationen von O2 und CO2 als Substrate und den pH-Wert als eine Schlüsselvariable zu beobachten, um optimale und hohe mikrobielle Aktivität sicherzustellen. Wenn O2 oder CO2 limitiert sind oder der pH-Wert zu stark abfällt, würden die Bakterien die Aktivität reduzieren und die Stickstoffumwandlung würde abnehmen. Nicht-invasive Methoden zur Überwachung dieser Parameter können helfen, die Auswirkungen von Substratlimitierung und pH-Wert auf die Nitrifikationsrate zu untersuchen, ohne das Experiment zu stören. In sogenannten Respirometrie-Batch-Experimenten können die Umwandlungsraten aus den O2-Aufnahmeraten abgeschätzt werden. Solange nur ein Prozess stattfindet (gewährleistet durch die Hemmung des anderen Prozesses), ist die Berechnung basierend auf der Stöchiometrie ziemlich genau. Dies spiegelt jedoch nicht das Zusammenspiel von AOB und NOB wider. Durch die Überwachung von nicht nur allein O2, sondern auch von pH und CO2 könnten respirometrische Batch-Experimente mit beiden Prozessen gleichzeitig untersucht werden, da die Änderung des CO2 relativ zum pH anzeigen könnte, welcher Prozess in welchem Ausmaß auftritt. In dieser Studie haben wir chemisch optische Sensorspots angewendet, die eine nicht-invasive Überwachung von Sauerstoff, CO2 und pH in den Kulturen erlauben, um diese Prozesse zu bewerten.
Material & Methoden
Die Eignung von PreSens pH-, CO2- und O2-Sensorspots (SP-HP5, SP-CD1, SP-PSt3) zur Untersuchung von Nitritation und Nitratation in Batchkulturen wurde mit Biomasse aus zwei Anreicherungsreaktoren im Labormaßstab, einem AOB und einem NOB, getestet. Ein definiertes Volumen an Biomasse wurde aus dem Reaktor entnommen, mit Leitungswasser gewaschen und dann in mineralischem Wachstumsmedium resuspendiert und belüftet. Der Batch-Lauf wurde gestartet, indem Ammonium (AOB) oder Nitrit (NOB) in das Batch-Gefäß zugegeben wurde, während pH, CO2 und O2 überwacht wurden. Sensorspots wurden in die Testgefäße integriert und mit den jeweiligen faseroptischen Transmittern (pH-1 mini, Fibox 3, pCO2 mini) nicht-invasiv ausgelesen. Es wurden keine Inhibitoren zugegeben, da die Bakterien aus Anreicherungen stammten und daher keine NOB-Aktivität in AOB-Durchläufen erwartet wurde.
Ergebnisse
Erweiterte respirometrische Assays, um alleinige AOB- und alleinige NOB-Aktivität zu testen, wurden durchgeführt, wobei O2 und CO2 Gehalt sowie der pH im Medium aufgezeichnet wurden. Das Ergebnis dieser Versuche ist in den Abbildungen 2 und 3 gezeigt. Der Sauerstoffgehalt nahm in beiden Assays, AOB und NOB, aufgrund des Sauerstoffverbrauchs der Bakterien während der Umwandlung von Ammonium bzw. Nitrit ab (Abb. 2A + 3A). Der Nitrierungsschritt (AOB-Aktivität) erzeugt H+, wodurch sich der pH-Wert senkte, wie in Abb. 2B zu sehen ist. Der CO2-Gehalt stieg mit der Abnahme des pH-Wertes aufgrund des Dissoziationsgleichgewichts. Bei Nitratbildung (NOB-Aktivität) blieb der pH-Wert konstant (Abb. 3B), während der CO2-Verbrauch durch NOBs während der Nitritoxidation sich durch eine langsame Abnahme der CO2-Konzentration zeigte.
Zusammenfassung
Die PreSens Sensorspots für pH, CO2 und O2 wurden erfolgreich zur Untersuchung der Nitrifikationskinetik in erweiterten Respirometrie-Assays eingesetzt. Die Ergebnisse zeigten, dass durch die kombinierten Messungen aller drei Parameter in einem einzigen Gefäß zusätzliche Informationen gewonnen werden können. Es wurde ein deutlich unterschiedliches Profil für pH und CO2 Messwerte während AOB- und NOB-Batch-Experimenten dokumentiert. Dies ermöglicht die Quantifizierung des relativen Anteils der NOB-Aktivität an der O2-Abnahme während gemischter Batch-Durchläufe (AOB und NOB). Da sowohl natürliche Systeme als auch Abwassereinigungsreaktoren immer AOB und NOB enthalten, sind erweiterte Respirometrie-Assays mit Überwachung von pH, CO2 und O2 ein nützliches Werkzeug für die schnelle Bewertung der Biomasseaktivität. In klassischen respirometrischen Assays wird nur O2 überwacht, da zusätzliche Elektroden oder Proben die Messung zu sehr stören würden. Allein nicht-invasive Messungen - wie mit den chemisch-optischen Sensorspots - ermöglichen solche erweiterten Respirometrie-Assays. Darüber hinaus verringert die Sensorspot-Technologie das erforderliche Reaktionsvolumen erheblich und eröffnet somit mehr Möglichkeiten und eine höhere Flexibilität bei der Untersuchung von Nitrifikationskinetiken.