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Evaluierung einer CO2 Sonde für die Langzeit-Überwachung in einem Rührkessel-Bioreaktor

Prototyp eines autoklavierbaren CO2 Sensors verwendet in Kulturen mit hoher und niedriger Zelldichte

Melissa Hill1, Marcelo Kern1, Sayantan Bose1, Athanas Apostolidis2
1GlaxoSmithKline, King of Prussia, PA, USA
2PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Deutschland

Bei der Kultivierung von Säugetierzellen ist Kohlendioxidgas ein wichtiger Faktor, um den pH-Wert im Medium zu stabilisieren und die Atmosphäre auf physiologische Werte für die jeweilige Zelllinie einzustellen. Die CO2-Werte in Bioreaktoren schwanken während des gesamten Laufs und können das Zellwachstum, die Lebensfähigkeit und die Qualitätsmerkmale beeinflussen, wenn die Werte zu hoch oder zu niedrig werden. Die CO2-Werte werden hauptsächlich mit Offline-Messungen überwacht. Daher besteht Bedarf an einer robusten, genauen CO2-Sonde für die kontinuierliche Überwachung.

Der Prototyp der optischen CO2 Sonde von PreSens verfügt über ein Edelstahlgehäuse und ein standardisiertes Gewinde, sodass er für Standard-Bioreaktoranschlüsse oder Anschlussadapter geeignet ist. Der Sensor wurde wie andere Sonden in einen Anschluss am Bioreaktordeckel integriert. Da optische Sensoren unabhängig von der Strömungsgeschwindigkeit der Probe sind, eignen sie sich ideal für Messungen in sich bewegenden Flüssigkeiten.
Wir haben eine neuartige optische CO2 Sensorsonde zur Überwachung der Zellkultur in einem Rührkessel-Bioreaktor getestet. Die Online-Messungen wurden mit Offline-Daten von Rapid Point und Nova Flex verglichen. Ein 6-tägiger Pilotlauf bei niedriger Zelldichte zeigte keine Drift des CO2-Signals und Schwankungen in der Messung korrelierten mit CO2-Einspülungen. In einem 14-tägigen Versuch bei hoher Zelldichte zeigte die Sonde nach Tag 8 eine größere Abweichung von den Referenzmessungen, was möglicherweise auf die hohe Zelldichte zurückzuführen war. In dem folgenden 14-tägigen Versuch bei niedriger Zelldichte wurde die CO2 Sonde nach Tag 5 neu kalibriert, da sie etwas niedriger Werte als die Offline-Daten anzeigte. Danach stimmten die Online-Daten gut mit den Referenzmessungen überein.

Material & Methoden

Die optische CO2 Sonde, mit einer Einweg-Optikkappe und an das CO2-1 SMA Messgerät angeschlossen, wurde über einen Anschluss in den Bioreaktordeckel eines 3-l-Glasreaktors integriert und vor der Inokulation mit einer CHO-Zelllinie in 1 × PBS autoklaviert. Online-CO2-Messungen wurden über die PreSens Measurement Studio 2 Software gesteuert und in Intervallen von 30 Sekunden oder bei Bedarf schneller gemessen, z. B. zu Beginn des Laufs oder während der Einpunktkalibrierung. Die PreSens Sonde wurde zu Beginn der Tests mit einem Siemens RAPIDPoint 500-Blutgassystemanalysator (Modell Nr. RP500) oder dem Nova Biomedical BioProfile FLEX Analyzer einpunktkalibriert. Die Online-Daten wurden mit Offline-Messwerten verglichen, die mit Rapid Point und Nova Flex ermittelt wurden.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt PreSens CO2-Messungen und Referenzdaten für einen Pilotlauf in einer Kultur mit niedriger Zelldichte (6 Millionen Zellen/ml) für 6 Tage. Der Pilotlauf wurde durchgeführt, um einen allgemeinen Überblick über die Leistung des optischen Sensors und mögliche Drift zu erhalten. Vor der Inokulation wurde die CO2 Sonde auf den Nova Flex-Messwert einpunktkalibriert. Die optischen CO2-Werte entsprachen gut den Rapid Point-Daten, lagen jedoch näher an den Nova Flex-Messungen. Während der gesamten 6 Tage des Laufs konnte keine Drift festgestellt werden. Schwankungen, die bei den Messungen der optischen CO2 Sonde beobachtet wurden, entsprechen den Zeitpunkten, zu denen CO2 in eingeströmt wurde.

Der folgende Versuch in einer Kultur mit hoher Zelldichte (40 Millionen Zellen/ml) dauerte 14 Tage (Abb. 2). Kalibrierungsdaten aus einem vorherigen Lauf wurden verwendet, bei dem die Sonde auf die Rapid Point-Messwerte einpunktkalibriert wurde. Im Vergleich zu Referenzmessungen waren die mit der Prototypsonde gemessenen optischen CO2-Werte in den ersten 8 Tagen etwas niedrig, und die Abweichung nahm für den Rest des Laufs zu. In diesem Zeitraum verursachte höchstwahrscheinlich die hohe Zelldichte diese Abweichung. Die hohe Zelldichte veränderte wahrscheinlich die chemische Umgebung des Reaktors derart, dass die am Tag 0 durchgeführte anfängliche Kalibrierung nicht genau war. Eine Einzelpunktkalibrierung an Tag 8 hätte jedoch für den Rest des Laufs hilfreich sein können.

Für den zweiten 14-tägigen Lauf wurde eine Kultur mit niedriger Zelldichte (maximal 6 Millionen Zellen/ml) verwendet (Abb. 3). Die optische CO2 Sonde wurde am Tag 0 erneut auf Rapid Point-Werte kalibriert. Wie für den vorherigen Versuch beobachtet, waren die optischen Messungen bis zum 5. Tag etwas niedrig. Eine weitere Einpunktkalibrierung wurde durchgeführt, die das Problem zu lösen schien und die optischen Messungen stimmten für den Rest des Laufs gut mit den Referenzdaten überein. An den Tagen 4 und 7 wurde eine bestimmte Menge Kulturvolumen aus dem Reaktor entfernt und durch frisches Medium ersetzt, um die Zellkultur niedrig und gesund zu halten. Aufgrund der vorübergehenden Entfernung von Zellen und Medien fielen die aufgezeichneten CO2-Werte vorübergehend ab, bis das Volumen im Bioreaktor wiederhergestellt war. Vom 13. Tag bis zum Ende zeigte die optische CO2 Sonde sehr hohe CO2-Werte. Die CO2-Werte in der Kultur stiegen schnell an, wie aus den Nova Flex-Messwerten hervorgeht, sodass der maximale Messbereich (> 25 %) des optischen Sensors überschritten wurde.

Zusammenfassung

Unsere Experimente zeigten, dass der Prototyp der CO2 Sonde erfolgreich zur Online-Überwachung der CO2-Werte in Zellkultur eingesetzt werden konnte. Nach der Einpunktkalibrierung stimmten die Messungen gut (innerhalb von 20% Unterschied) mit den offline ermittelten Referenzwerten überein. Das Finden des optimalen Zeitpunkts für eine zweite Einpunktkalibrierung während Langzeitmessungen erfordert jedoch zusätzliche Optimierung. Obwohl eine Bewertung des Sensors für verschiedene Zellkulturanwendungen wünschenswert wäre, legen unsere Daten nahe, dass diese Technologie für die Langzeitüberwachung des CO2-Gehalts in Rührkessel-Bioreaktoren geeignet ist.

Danksagung
Das zu diesem Bericht führende Projekt wurde von der gemeinsamen Initiative Innovative Medicines Initiative 2 im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 777397 finanziert. Dieses gemeinsame Unterfangen erhält die Unterstützung des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union und EFPIA.

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