Wieviel O₂ ist wirklich in Ihrer Zellkultur?

Der Nobelpreis für Medizin 2019 hat alle darauf aufmerksam gemacht, dass Säugetierzellen auf perizelluläre Sauerstoffkonzentrationen mit sehr komplexen, gewebespezifischen und streng kontrollierten Veränderungen der Genexpression reagieren, was zu Veränderungen des Stoffwechsels und anderen Aspekten der Zellphysiologie führt. Die meisten bekannten Fakten über die zelluläre Reaktion auf verschiedene O₂-Niveaus wurden aus der Untersuchung von Zellen in Gewebekulturen gewonnen. Anhaftende Zellen werden routinemäßig unter statischen Bedingungen in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 95% Umgebungsluft und 5% CO₂ bei 37 ° C gezüchtet. Es ist bekannt, dass die Höhe der Kulturflüssigkeit, die die anhaftenden Zellen bedeckt, entscheidend ist, um eine ausreichend schnelle Diffusion von O₂ von der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche zum Boden der Kulturschale zu ermöglichen. Die Details dieses vertikalen Sauerstoffgradienten (VOG) sind jedoch nur wenig bekannt, da er von mehreren Parametern beeinflusst wird: (I) der Respirationsrate der Zellen, (II) der Zellzahl pro Flächeneinheit, (III) der Zusammensetzung des Mediums , da es bestimmt, welche Stoffwechselwege aktiv sind, (IV) das Gesamtvolumen des sauerstoffhaltigen Mediums und (V) die Geschwindigkeit des Eindringens von O₂ aus der Atmosphäre in das Medium. Daher ist die Schätzung des VOG von der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (Quelle) zu den Zellen am Boden der Schale (Senke) (siehe Abb. 1) ein multifaktorielles Problem, das eine experimentelle Bewertung für verschiedene Zellkulturbedingungen und -geometrien erfordert. Detailliertes und zeitaufgelöstes Wissen über diesen Gradienten ermöglicht eine bessere Kontrolle und Standardisierung der O₂-Niveaus, mit denen Zellen konfrontiert sind. Es ist offensichtlich, dass Unterschiede in der Sauerstoffversorgung der Zellen eine potenzielle Ursache für eine schlechte Reproduzierbarkeit von Zellexperimenten von Labor zu Labor sein können, da pO₂ den Energiestoffwechsel direkt beeinflusst und als starker Hebel für die Genexpression und phänotypische Veränderungen fungiert.

Das MIOS-System wurde in NRK-Zellkulturen mit einer Flüssigkeitshöhe von ca. 6 mm, vom Boden der Kulturschale bis zur Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche, angewendet. Das MIOS deckt die volle Flüssigkeitshöhe von 0 bis 6 mm ab und ermöglicht eine kontinuierliche Überwachung des VOG. Abbildung 3A zeigt die Imaging-Daten des im Medium entstandenen VOG in Pseudofarben codiert. Die linke Seite zeigt Bedingungen nahe der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche. In diesen obersten Flüssigkeitsschichten bis zu 2 mm unterhalb der Grenzfläche entspricht die mittlere O₂-Sättigung den Inkubatorbedingungen (95 % Luftsättigung). Offensichtlich kompensiert der über die Grenzfläche (1,4 cm²) eindringende Sauerstoff aus der Umgebungsluft die Sauerstoffdiffusion zu den verbrauchenden Zellen. Tief in der Zellkulturflüssigkeit (2 bis 4 mm von der Oberfläche entfernt) wird ein annähernd konstanter Gradient beobachtet. Innerhalb dieser Zone nimmt der Sauerstoffgehalt von 95 % Luftsättigung auf 38 % Luftsättigung in 2 mm Abstand von den Zellen ab. Dieser nahezu lineare Gradient zeigt die zunehmende Sauerstoffabnahme in den verschiedenen Flüssigkeitsschichten, verursacht durch die Atmungsaktivität der Zellen und eine unzureichend schnelle diffusive O₂-Zufuhr von der Grenzfläche. In der Flüssigkeitsschicht 1 mm über der Zellschicht fällt der lokale O₂-Gehalt auf 20% Luftsättigung nahe an der Zelloberfläche. Es entsteht eine Verarmungszone, und die Zellen am Boden der Schale weisen einen signifikant niedrigeren O₂-Gehalt auf, als dies aufgrund des O₂-Gehalts in der Inkubatoratmosphäre und der Löslichkeit von O₂ in physiologischen Puffern zu erwarten wäre. In Wirklichkeit sind Zellen schweren hypoxischen Bedingungen ausgesetzt, wenn sie in einem normoxischen Inkubator gezüchtet werden. Die damit einhergehenden Veränderungen des Energiestoffwechsels und des funktionellen Zellphänotyps müssen noch untersucht werden, beispielsweise durch systematischen Vergleich von Zellen unter statischen und unter Fließbedingungen.
Beim Wechsel von der lokalen zur zeitabhängigen Analyse kann die O₂-Konzentration innerhalb von 0,3 mm Mediumhöhe über der Zellschicht (= Volumen von Interesse VOI) im gleichen Experiment 24 Stunden nach dem Mediumaustausch (Abb. 4) quantitativ erfasst werden. Das VOI wurde alle 10 Minuten gemittelt und als Funktion der Zeit aufgetragen (Abb. 4B). In den ersten 6 Stunden nach dem Mediumaustausch nahmen die O₂-Werte im VOI von anfänglich 55 % Luftsättigung auf konstante Werte von 20% Luftsättigung ab, was auf hypoxische Zustände nach einer Kulturzeit von nur 6 Std. unter den Bedingungen in diesem Experiment (6 mm Flüssigkeitshöhe) hinweist. Das anfänglich sauerstoffhaltige, frische Medium ist aufgrund der kontinuierlichen Zellatmung und der unzureichenden O₂-Eintritts- / Diffusionsrate an O₂ abgereichert. 20 % Luftsättigung, der stationäre Zustand nach 6 h, betragen 1,35 mg/l oder 42,1 µmol/l O₂ im VOI.

NRK-Zellen wurden unter Bedingungen, die allgemein als "Standardbedingungen" angesehen werden, bei 37 ° C in einem herkömmlichen Inkubator mit stabilen 5 % CO₂ in der angefeuchteten Atmosphäre kultiviert. Die verbleibenden 95 % der Inkubatoratmosphäre bestanden aus 20,9 % O₂ bei 1020 mbar Umgebungsluftdruck. Somit beträgt der O₂-Gehalt unter normoxischen Bedingungen 19,9 % (142,9 Torr) oder in wässrigen Medien (physiologischer Salzgehalt) 6,4 mg/l oder 199,9 mol/l gelösten Sauerstoff. Es wird allgemein angenommen, dass lebende Zellen in Kultur während ihrer gesamten in vitro Lebensdauer diesem pO₂ ausgesetzt sind. Da Zellen jedoch O₂ mit individuellen Raten verbrauchen und der O₂-Eintrag in Zellkulturgefäßen mit unterschiedlichen Geometrien unterschiedlich ist, ist der tatsächliche pO₂, dem die Zellen ausgesetzt sind, häufig signifikant unterschiedlich. Dies kann für Unterschiede in der Stoffwechselaktivität oder sogar für funktionelle Phänotypen verantwortlich sein. Dementsprechend ist es für standardisierte und reproduzierbare Zellkulturexperimente obligatorisch, die lokale O₂-Verfügbarkeit in einem bestimmten experimentellen Szenario zu kennen und zu kontrollieren. Der vorgestellte MIOS-Sensor hilft dabei, die aktuellen Einschränkungen bei der Beurteilung der lokalen O₂-Verfügbarkeit in Kulturen zu überwinden. Zusammen mit dem VisiSens™ Aufbau ermöglicht es die Messung des VOG in Zellkulturflüssigkeiten zwischen der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche und der Zellschicht am Boden von 24-Well Platten. Unsere Studie zeigt deutlich, wie sich die Sauerstoffversorgung im Medium sowohl im vertikalen Profil als auch im Laufe der Zeit ändert. Die Daten belegen quantitativ, dass Zellen, die nominell unter normoxischen Bedingungen kultiviert wurden, in ihrer direkten lokalen Mikroumgebung eine Hypoxie erfahren. Der Grad der O₂-Abreicherung im perizellulären Bereich ist multifaktoriell und hängt als solcher von der Flüssigkeitshöhe und der Stoffwechselaktivität der untersuchten Zelle ab. Die MIOS-Technik bietet quantitative Einblicke in die tatsächlichen O₂-Niveaus in der zellulären Mikroumgebung, wenn sie unter "standardisierten" Inkubatorbedingungen mit 95 % Luftsättigung kultiviert wird. Es zeigt den Grad der Hypoxie für gegebene experimentelle Einstellungen und kann die Grundlage für eine genauere Standardisierung der Zellkulturbedingungen und eine verbesserte Reproduzierbarkeit von zellbasierten Assays sein.