Nicht-invasive Online-Sauerstoffmessung

Bakterielle Toxizitätstests in der pharmakologischen Wirkstoffforschung

Die Messung der Sauerstoffkinetik in Respirations-Inhibitionstests ist von zentraler Bedeutung für die pharmakologische Wirkstoffforschung und die toxikologische Prüfung von Chemikalien (REACH). Der neue SDR SensorDish® Reader ermöglicht erstmalig die nicht-invasive, simultane Online-Aufzeichnung in 24 Well Platten. Die Studie beschreibt die Verwendung des Systems in einem bakteriell-respiratorischen Toxizitätstest.

Der Pseudomonas putida (P. putida) -Test zur Hemmung des Sauerstoffverbrauchs (1) wird verwendet, um die Wirkung einer Testsubstanz auf die Zellatmung in Bakterien unter Verwendung von Sauerstoffelektroden zu untersuchen. Herkömmliche Sauerstoffelektroden sind jedoch für Hochdurchsatzanalysen ungeeignet, da eine effektive Miniaturisierung der Elektroden - die Voraussetzung für den gleichzeitigen Einsatz in kleinvolumigen Proben - nur begrenzt möglich ist und invasive Messungen zu Kontaminationen führen könnten. Dieser Test wurde für das 24 Well Format des SensorDish® Readers angepasst. Der SensorDish® Reader liest den Sauerstoffgehalt berührungslos mittels optischer Sensoren am Boden jedes Wells der 24-Well Platte (OxoDish®) aus. Mit der entsprechenden Software können bis zu 10 Instrumente mit insgesamt 240 Proben gleichzeitig überwacht werden.

Probenvorbereitung

P. putida Migula (DSM 50026) wurde 24 h auf Standard-Agar S1 gezüchtet, und eine Übernachtkultur (16 h) davon wurde in einem S1-Medium herangezogen. Die Bakterien wurden mit einem Phosphatpuffer (pH: 7,2, 50 mM) gewaschen und auf eine optische Dichte (OD₄₃₆) von 0,4 Verdünnung eingestellt. Kupfersulfatlösung mit acht Konzentrationen im Bereich von 1 · 10^-4 bis 2 · 10^-7 wurde als Testsubstanz verwendet. In Abweichung vom Standardverfahren wurde eine höhere Bakterienkonzentration verwendet und 100 mM NaCl zur Testlösung gegeben. Eine Mischung von 0,4 ml der Bakterienlösung, 0,4 ml einer 2,5 M Glucoselösung und 19,2 ml der Kupfersulfatlösung wurde 30 Minuten bei 23 ºC in einem Schüttelkolben unter Rühren vorinkubiert. Aus dieser Mischung wurden 3 ml / Vertiefung auf das OxoDish® übertragen und der Sauerstoffgehalt der Proben wurde 15 Minuten lang ohne Rühren mit dem SensorDish® Reader aufgezeichnet.

Die Kinetik (Abb. 2) zeigte, dass niedrige Kupfersulfatkonzentrationen (bis zu 10^-6 M) keine hemmende Wirkung auf den oxidativen Metabolismus hatten. Der Sauerstoffverbrauch der Kultur nahm mit zunehmender Kupfersulfatkonzentration ab; bei Kupfersulfatkonzentrationen von 4,5 · 10^-5 und darüber wurde die Bakterienatmung vollständig inhibiert. Der Vergleich der Kinetiken für die ungehemmte bakterielle Atmung und der mit den Testsubstanzen in verschiedenen Konzentrationen behandelten Bakterien erlaubte es, den Inhibitionsgrad anhand der Steigung zu berechnen. Die Hemmung ergibt sich aus dem Quotienten bekannter Messwerte: 100 x (Steigung ohne Hemmung - Steigung mit Hemmung) / Steigung ohne Hemmung. Aus der resultierenden Dosis-Antwort-Kurve (Abb. 3) wurde ein EC50-Wert von 5,0 · 10^-6 (1,25 mg/l) Kupfersulfat ermittelt. Die EC50 (halbmaximal effektive Konzentration) ist definiert als die Testsubstanzkonzentration, die im Testorganismus zu einer Hemmung des Sauerstoffverbrauchs von 50 % führt.

Simultanes Screening mehrerer Proben

Die Ergebnisse stimmen sehr gut mit den bekannten Informationen über die Toxizität von Kupfersulfat überein und bestätigen die Ergebnisse einer früheren Studie (2). Sie zeigen das große Potenzial der neuen Messtechnik für pharmakologisch-toxikologische Screeningtests. Der SensorDish® Reader ermöglicht die schnelle, gleichzeitige Messung einer großen Anzahl von Proben. Da die Probe während der Messung nicht bewegt wird, ist der passive Sauerstoffeintrag über die kurze Messdauer von 15 Minuten vernachlässigbar, so dass die Probe nicht abgedeckt werden muss. Die Anforderungen an Kulturmedium, Bakterienmenge und Testsubstanz sind im Vergleich zu denen der herkömmlichen Methode (Testvolumen von 100 ml auf 3 ml verringert) sehr niedrig, ebenso wie die für die Tests benötigte Zeit, da das System einfach anzuwenden ist und keine zusätzliche Kalibrierung erfordert. Kostenintensive und empfindliche Sauerstoffelektroden können eingespart werden. Der SDR SensorDish® Reader bietet eine kostengünstige und schnelle Testmethode für die Wirkstoffforschung und Toxikologie.

Referenzen
1. Pseudomonas putida Atmungshemmtest (Pseudomonas putida Respiration Inhibition Test), DIN 38412, Part L27:1992.
2. Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser- und Schlamm-Untersuchung (German Standard Procedure for Water, Wastewater, and Sediment Testing), Part VI, Wiley-VCH, Weinheim (2001)