Online Überwachung einer C. glutamicum Kultur in Ultra Yield® Kolben

Ultra Yield® Kolben haben ein spezielles Design mit 6 Schikanen, das eine bessere Belüftung verspricht. Das macht diese Einweg-Schüttelkolben interessant für E. coli und andere mikrobielle Kulturen. Im Vergleich zu den PreSens Sensor Flasks SFS (Corning) sind die Ultra Yield® Flasks nur leicht durchsichtig. Hier haben wir einen 2,5-Liter Ultra Yield® Kolben mit dem SFR vario Sensormodul für Online-Messungen während einer C. glutamicum Batch-Kultur verwendet. Wir haben Sauerstoff- und pH-Sensoren am Boden des Kolbens integriert, die vom SFR vario ausgelesen werden. Die PreSens Flask Studio Software berechnete dann automatisch OUR aus den Sauerstoffmessungen. Dafür wurde der kLa-Wert der Ultra Yield® Kolben bestimmt, der sich in einem ähnlichen Bereich wie der von PreSens Sensor Flasks SFS befindet. Die Biomasse wurde optisch überwacht - Licht wird durch den Kolbenboden eingestrahlt, von den Zellen in der Kulturbrühe gestreut und das zurückgestreute Licht wird dann mit dem SFR vario detektiert.

C. glutamicum wurde in einem 2,5-Liter Ultra Yield® Kolben mit 20 % Füllvolumen bei 30 °C und 300 U/min (Schütteldurchmesser 25 mm) in einem komplexen Medium gezüchtet. Der Kolben wurde mit einer passenden Corning-Kappe verschlossen. Ein Sauerstoff- und ein pH-Sensor (SP-PSt3, SP-HP5) wurden am Boden des Kolbens integriert und Sauerstoff, OUR, pH und Biomasse wurden über einen Zeitraum von 25 Stunden mit dem SFR vario im Schüttelinkubator überwacht (siehe Abb. 1). Die Proben für die Offline-OD₆₀₀-Messungen wurden aus einer Parallelkultur entnommen, die unter den gleichen Bedingungen wuchs.

Abbildung 2 zeigt die online aufgezeichneten Daten der C. glutamicum Kultur und offline ermittelte OD₆₀₀ Werte. Nach etwa 1,5 Stunden setzt ein erhöhter Sauerstoffverbrauch ein. In den nächsten 10 Stunden zeigen die DO- und OUR-Kurven mehrere Spitzen, die auf mehrere Stoffwechselverschiebungen aufgrund des Verbrauchs verschiedener Kohlenstoffquellen (z. B. Glucose, Acetat) im Komplexmedium hinweisen. Der pH-Wert sinkt bei hoher Stoffwechselaktivität um 0,24, wobei die Kultur sauerer wird, da sich Stoffwechselprodukte im Kulturmedium anreichern. In der zweiten Phase der Kultivierung nach 7 Stunden führt ein Wechsel von Kohlenhydraten zu Peptiden und Aminosäuren als Kohlenstoffquelle zu einer starken Basifizierung des Mediums, die durch den HP5 Sensorspot perfekt aufgelöst werden kann. Nach einer kurzen Verzögerungsphase zu Beginn zeigt die Biomassekurve ab Stunde 4 ein deutliches exponentielles Wachstum, das mit der erhöhten Sauerstoffaufnahmerate korrespondiert. Nach 9 Stunden stoppt das exponentielle Wachstum, und die Biomasse nimmt bis zum Abbruch der Kultivierung minimal ab. Der Sauerstoffverbrauch hält noch weitere 5 Stunden an, was darauf hindeutet, dass weiterhin Stoffwechselaktivität stattfindet, bei der wahrscheinlich einige Zellen verstoffwechselt werden, bevor die Sterbephase einsetzt. Die Offline-OD₆₀₀-Daten stimmen gut mit den Online-Biomassendaten überein.  Die geringfügige Abweichung zwischen den online und offline gemessenen Daten könnte darauf zurückzuführen sein, dass die Offline-Daten aus einer Parallelkultur stammen. Unter den gewählten Bedingungen wird der Sauerstoff nie limitierend und der DO-Wert fällt nicht unter 40 %. Die SFR vario Daten zeigen, dass zwar noch eine gewisse Stoffwechselaktivität vorhanden ist, aber nach 10 Stunden kein Wachstum mehr stattfindet und die Kultur dann beendet werden kann.

Unsere Tests haben gezeigt, dass mit dem SFR vario in nur leicht durchsichtigen Polypropylen-Schüttelkolben aussagekräftige Online-Messdaten gewonnen werden können. In diesem Beispiel konnten wir die Entwicklung der Biomasse und die Stoffwechselaktivität in Ultra Yield® Kolben, die mit optischen Sensorspots ausgestattet sind, im Detail verfolgen. Die mit dem SFR vario gleichzeitig erfassten Online-Daten mehrerer Parameter haben sich als wertvoller Einblick in die Stoffwechselprozesse erwiesen und ermöglichen eine genaue Abschätzung der Wachstumsphasen sowie der Nährstoffverfügbarkeit, indem man indirekt Informationen aus den DO- und pH-Daten gewinnt.