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Online Monitoring von S. cerevisiae Kultur mit dem SFR vario
Neue Online-Biomassedaten stimmen mit Offline-Messungen sehr gut überein
Dylan Haskew1, Gernot T. John2, und Dogan Ornek1
1Upstream Process Development, FUJIFILM Diosynth Biotechnologies U. S. A., Inc., USA
2PreSens Precision Sensing GmbH, Deutschland
Das neue SFR vario System wurde verwendet um einen Modellprozess mit Saccharomyces cerevisiae zu untersuchen, und O2, OUR, pH und Biomasse online in 2 l Schüttelkolben zu überwachen. Zwei Anfangsdurchläufe und ein abschließender Durchlauf - um das Modell zu bestätigen - wurden durchgeführt. Die aufgenommenen Biomassedaten wurden mit optischer Dichte (OD) korreliert, indem ein lineares Kalibrierungsmodell angewendet wurde. Online-Daten, die mit dem SFR vario System gesammelt wurden, wurden dann mit Offline-Messungen verglichen. Aufzeichnungen in allen drei Läufen ergaben vergleichbare Daten, die ebenfalls gut mit den Offline-Messungen übereinstimmten. Das SFR vario verbessert durch seine einfache Handhabung die Kulturüberwachung, und Probenahmen sind nicht notwendig; darüber hinaus liefert es einen detaillierteren Überblick über die Kulturleistung.
Das neue SFR vario ermöglicht die Online-Überwachung von Sauerstoff, pH-Wert und Biomasse in Schüttelkolben und erlaubt darüber hinaus die automatische Berechnung der Sauerstoffaufnahmerate (OUR). Das System wird direkt im Schüttelinkubator installiert und kabellos über Bluetooth gesteuert. Biomasse wird optisch gemessen, und die Reflexionswerte können mit der optischen Dichte (OD), dem Zelltrockengewicht (CDW) oder der Zellkonzentration korreliert werden. Dazu wird in einem Testlauf vor der eigentlichen Kultivierung ein Kalibrierungsmodell erzeugt. Das System wird mit Schüttelkolben verwendet, in die am Boden optische Sauerstoff- und pH-Sensoren integriert sind; diese Sensoren werden vom Hersteller vorkalibriert und die mitgelieferten Kalibrierdateien können einfach in die SFR vario Software importiert werden. Wir haben die Leistungsfähigkeit dieses Gerätes an einem Modellprozess mit S. cerevisiae getestet und dabei Online-Ergebnisse mit durch klassische Probenahme- und Messmethoden gewonnenen offline pH- und OD-Werten verglichen. Zwei Anfangsdurchläufe und ein Modellbestätigungsdurchlauf wurden in 2 l Schüttelkolben mit integrierten O2- und pH-Sensoren bei 28 °C, 225 UpM mit einem Schütteldurchmesser von 1,0 Zoll durchgeführt.
Sauerstoffmonitoring & OUR
Der Gehalt an gelöstem Sauerstoff (DO) wurde in diesem Modellprozess bisher nicht verfolgt. DO-Messungen mit dem SFR vario zeigten für alle drei Kultivierungsläufe ähnliche Profile (Abb. 2). Zellwachstum führte zu einer kontinuierlichen Abnahme der Sauerstoffkonzentration im Medium. Als Glukose aufgebraucht war, ging S. cerevisiae dazu über das zuvor produzierte Ethanol zu verbrauchen. Während dieser metabolischen Verschiebung war der Sauerstoffverbrauch reduziert, was durch einen kleinen Peak in den Sauerstoffmessungen bei 55 h Kultivierung angezeigt wird. In allen drei Läufen setzte nach etwa 65 h eine Sauerstofflimitierung ein. Zur automatischen OUR-Berechnung wurde der kLa vor Beginn der Kultivierung in die Software eingegeben. kla für Lauf 2 und 3 war 50, während Lauf 1 einen falschen kLa-Wert von 10 aufwies. Der abweichende kLa von Lauf 1 verursachte bei der Berechnung der OUR im Vergleich zu Lauf 2 und 3 Diskrepanzen (Abb. 2). Diese beiden Kulturen zeigten wieder ähnliche Profile mit steigender Sauerstofflimitierung. Der Substratwechsel zeigte sich auch in einem kleinen Abfall der OUR. Sauerstoffmessungen und OUR-Berechnungen mit dem SFR vario lieferten konsistente Ergebnisse für alle drei Kulturläufe, mit Ausnahme der OUR von Lauf 1, was durch den falschen kLa-Wert verursacht wurde.
pH-Messungen
Wir haben offline pH-Messungen zum Vergleich mit den online gemessenen SFR vario-Daten durchgeführt. Aufgrund falscher Platzierung des Kolbens über der Optik funktionierte das Sensorauslesen und damit die online pH-Überwachung von Lauf 1 nicht richtig. Die anderen beiden Läufe lieferten ähnliche pH-Profile (Abb. 3). Im Falle eines signifikanten Versatzes von gemessenem pH-Wert mit einem bekannten Anfangs-pH-Wert, bietet die SFR vario Software eine pH-Einstellfunktion, eine Ein-Punkt-Kalibrierung um alle folgenden Messungen anzupassen. Diese Funktion wurde in diesen Experimenten nicht verwendet, und es stellte sich heraus, dass die Offline- und Online-Messdaten gut übereinstimmten. Dies beweist, dass die Vorkalibrierung der in den Schüttelkolben integrierten pH-Sensoren genau war. Die Online-Messungen von Lauf 2 und 3 korrelierten besser untereinander als die Offline-Messergebnisse.
Biomasse & OD-Überwachung
Wir zeichneten die Werte für die Biomasse-Reflexion mit dem SFR vario auf und führten einen Testlauf durch, um offline OD-Messungen zur Korrelation mit den Online-Ergebnissen zu erhalten. Die Biomassedaten zeigten für alle drei Läufe vergleichbare Trends (Abb. 4). Die Option, den Winkel-Offset für Biomasse-Messwerte anzupassen, reduzierte das Signal-Rauschen und die Messauflösung konnte verbessert werden. Die online gemessenen Daten zeigten nach 55 h wieder einen kleinen Knick, während eine metabolische Verschiebung zu einem anderen Substrat stattfand und das Wachstum kurzzeitig stagnierte (wie auch in den Sauerstoffmessungen zu sehen war). Wir verwendeten ein lineares Modell mit der Formel y = a * x - b, um die OD mit den Reflexionswerten zu korrelieren, nahmen mehr Daten auf und verbesserten den Messwinkel weiter. Beim Vergleich der Offline-OD mit den OD-Werten, die in zwei parallelen Kulturen von Lauf 3 gesammelt wurden, zeigte sich eine starke Leistung der Modellkultivierung und eine gute Korrelation der Daten (Abb. 5).
Zusammenfassung
Unsere Experimente mit dem SFR vario in einem Modellprozess mit S. cerevisiae haben gezeigt, dass dieses Gerät genaue Daten liefert, die mit klassischen Offline-Messungen konsistent sind. Bislang nicht verfolgte Parameter konnten kontinuierlich aufgezeichnet werden, was eine detailliertere Betrachtung der Kulturleistung während der verschiedenen Phasen erlaubte. Die Online-Überwachung mehrerer Parameter mit nur einem Gerät liefert reproduzierbare Daten mit minimalem Aufwand. Sobald das Kalibrierungsmodell für die Biomassekorrelation erstellt ist, was schnell und einfach durchgeführt werden kann, ist keine Probenahme mehr erforderlich. Das Kontaminationsrisiko ist auf ein Minimum reduziert. Die zusätzliche Monitoring-Funktion für Temperatur und Schüttelgeschwindigkeit ist sehr praktisch, da diese Informationen über die genauen Kulturbedingungen mit den Daten gespeichert und später während der Analyse abgerufen werden können. Das SFR vario erwies sich als ausgezeichnetes Werkzeug zur Überwachung der Kulturleistung.