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Adhäsives Zellwachstum und Mikroskopie auf O2 und pH Sensorfolien

Einfluss von Beschichtung auf die Zelladhäsion an VisiSens™ Sensorfolien SF-RPSu4 und SF-HP5R

C. Schmittlein1, R. J. Meier2, G. Liebsch2, J. Wegener1,3
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Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik, Universität Regensburg, Deutschland
2PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Deutschland
3Fraunhofer-Einrichtung für Mikrosysteme und Festkörper-Technologien (EMFT), Regensburg, Deutschland

Suspensionen von Madin-Darby Canine Kidney-Zellen (MDCK-II) wurden auf VisiSens™ Sensorfolien SF-RPSu4 (O2) und SF-HP5R (pH) plattiert, die in regulären Petrischalen integriert waren. Die Zelladhäsion auf einer regulären Petrischalen-Oberfläche, unbeschichteten Sensorfolien und mit verschiedenen adhäsionsfördernden Substanzen beschichteten Sensorfolien wurde durch Anfärben und mikroskopische Analyse bestimmt. Nachdem die Anfangsvorgaben festgelegt waren, wurden normale Ratten-Nierenzellen (NRK), Rinderaorta-Endothelzellen (BAEC) und humane Glioblastomzellen (U-373 MG) in diese Studie eingeschlossen. Wir haben festgestellt, dass die Sensorfolien keinen toxischen Effekt auf die verschiedenen Zelllinien haben und dass die Zellen auf den Sensorfolien gut wachsen, mit keinem signifikanten Unterschied zu regulären Zellkultursubstraten.

Das Züchten von Tierzellen direkt auf der Oberfläche einer O2 oder pH Sensorfolie in Kombination mit Fluoreszenzimaging macht es möglich, die Konzentration der beiden Analyten in der direkten Mirkoumgebung der anhaftenden Zellen zu quantifizieren, anstatt deren Konzentration mit einem zellfreien Sensor in einiger Entfernung in der Masse zu messen. Der geringe Abstand zwischen Sensorfolie und Zelle von nur 50 bis 200 nm ermöglicht lokale Messungen der Sauerstoffkonzentration und des pH-Wertes an der Zelloberfläche mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung. Dadurch lässt sich die inhärente Latenzzeit integrierender Sensoren vermeiden, die mehrere Zelldurchmesser entfernt platziert werden, was oft sehr positionsabhängig ist und zusätzlich durch eine komplexere Diffusion und Konvektion des Analyten beeinflusst wird. Diese Studie befasst sich mit den Auswirkungen einer Sensorbeschichtung mit adhäsionsfördernden Substanzen und die nachfolgende Sensorleistung.

Material & Methoden

MDCK-II und NRK-Zellen (Leibniz-Institut DSMZ, Deutschlang), BAEC (zur Verfügung gestellt von Dr. Zink und Prof. Rösen vom Diabetes-Forschungsinstitut Düsseldorf, Deutschland) und U-373 MG Zellen (zur Verfügung gestellt von Prof. Buschauer, Institut für Pharmazie, Universität Regensburg, Deutschland) wurden in subkonfluenter (5,0 x 104 Zellen cm-2) und konfluenter (4,5 x 105 Zellen cm-2) Zelldichte auf den Sensorfolien ausplattiert.
Die bildgebenden Sensorfolien SF-RPSu4 und SF-HP5R (PreSens) wurden als Zellkultursubstrat verwendet. Die SF-RPSu4 Sensorfolien bestehen aus einer rötlichen, sauerstoffempfindlichen Schicht auf einer transparenten Trägerfolie, und einer weißen optischen Isolierschicht (OIW), die leicht durch Abziehen entfernt werden kann (Abb. 1). Die sauerstoffempfindliche Schicht hat andere Oberflächeneigenschaften als die optische Isolierschicht, so dass sowohl Sensoren mit als auch ohne OIW als Zellsubstrat getestet wurden. pH Sensorfolien werden mit einer nicht entfernbaren OIW-Schicht geliefert, so dass hier nur ein Folientyp (mit OIW) getestet wurde. Die Sensorfolien wurden mit einem biokompatiblen Silikonkleber (SG-1) am Boden von Standard-Petrischalen mit 3,5 cm Durchmesser (Saerstedt) angebracht. Die funktionalisierten Schalen wurden 1 Minute lang violettem Ar-Plasma ausgesetzt, um sie vor der Verwendung zu reinigen und zu sterilisieren. Fötales Kälberserum (FCS), Fibronektin, Gelatine und Poly-L-Lysin wurden als adhäsionsfördernde Beschichtungen verwendet und wie in Tabelle 1 aufgelistet auf die Sensorfolien aufgebracht.
24 Stunden nach dem Ausplattieren wurden die Zellen auf O2 Sensorfolien mit einer Lebendfärbung behandelt, die aus 2 µM Calcein-AM (Invitrogen, Ex 488 nm, Em 530 nm) und 4 µM Ethidium-Homo-Dimer (Biotrend Chemikalien, Ex 528 nm, Em 617 nm) in PBS++ (37 °C, 30 Min.) bestand. Da die Eigenschaften der pH Sensorfolien diese Art der Lebend/Tot-Färbung stören würden, wurden die Zellen auf pH Sensorfolien mit TRITC-Phalloidin (Invitrogen, Ex 515 nm, Em 650 nm) gefärbt, um die Architektur des Actin-Zytoskeletts zu dokumentieren. Da beide Sensorfolien nicht transparent sind, wurden die Zellen mittels eines aufrecht stehenden konfokalen Laserscan-Mikroskops (Nikon Eclipse 90i) bei zehnfacher Vergrößerung visualisiert.

Table of concentrations and conditions for sensor foil coating
Tab. 1: Konzentrationen und Inkubationsbedingungen für die einzelnen Materialien, mit denen die Sensorfolien beschichtet wurden, um die Anhaftung suspendierter Zellen zu erleichtern.

Zelladhäsion auf O2 Sensorfolien SF-RPSu4-OIW

O2 Sensorfolien mit optischer Isolierschicht (SF-RPSu4-OIW) wurden mit verschiedenen adhäsionsfördernden Substanzen (siehe Tab. 1) beschichtet, um den individuellen Einfluss der Beschichtung auf die Zelladhäsion zu untersuchen. Zelladhäsion auf unbeschichteten Sensorfolien (roter Kasten in Abb. 2) und Standardzellkultur-Petrischalen wurden als Referenz verwendet. Abbildung 2A zeigt subkonfluente MDCK-II Zellen nach Leben/Tot-Färbung durch CAM/EtHD. Die grüne zytoplasmatische Fluoreszenz von CAM zeigt lebende Zellen auf allen Substraten, mit nur wenigen rot fluoreszierenden Kernen toter Zellen. Auf sowohl beschichteten als auch unbeschichteten Sensorfolien zeigt jedoch ein Teil der Zellen nur eine schwache Adhäsion an das Substrat und nimmt eine abgerundete Morphologie an. Die Anzahl der voll ausgebreiteten Zellen ist bei behandelten und unbehandelten Sensorfolien im Vergleich zu Kontrollbedingungnen niedriger. Die Anzahl der durch die rote Kernemission von EtHD markierten toten Zellen ist nicht erhöht, wenn Zellen auf Sensorfolien kultiviert werden, was darauf hinweist, dass die Folien nicht toxisch sondern nur weniger adhäsiv sind.
In Abbildung 2B gruppierte mikroskopische Aufnahmen zeigen die Ergebnisse, wenn sich 24 Stunden nach dem Ausplattieren vollständige Zellschichten gebildet haben. Die Lebendfärbung von Zellen, die auf unbeschichteten, mit Fibronektin und Gelatine beschichteten Sensorfolien kultiviert wurden, zeigt lebende Zellen und eine ähnliche Zellabdeckung wie bei der Kontrolle. die Anzahl der toten Zellen auf nicht beschichteten Folien ist jedoch im Vergleich zu den Referenz- und den beschichteten Sensorfolien um etwa 50 % erhöht. Darüber hinaus fehlt den unbeschichteten Sensorfolien eine konfluente Zellschicht, die sich im Gegensatz zu den beschichteten Folien noch nicht vollständig gebildet hat.

Zelladhäsion auf O2 Sensorfolien SF-RPSu4 ohne OIW

MDCK-II Zellen können direkt auf der Oberfläche der sauerstoffempfindlichen Schicht der Sensorfolie kultiviert werden, wie in Abbildung 3 gezeigt ist. Die Ergebnisse zeigen keinen signifikanten Unterschied zwischen Kontrolle, beschichteten und unbeschichteten Sensorfolien. Die zusätzliche Beschichtung bewirkte weder eine verbesserte Adhäsion noch gab es eine signifikant unterschiedliche Anzahl an toten Zellen auf einem der Substrate, insbesondere wenn die Zellen bis zur Konfluenz wachsen konnten.

Zusätzlich wurden drei weitere Zelllinien analysiert. Mikroskopische Aufnahmen von BAEC, NRK und U-373 Zellen, die CAM und EtHD ausgesetzt waren, sind in Abbildung 4 zusammengestellt. Ähnlich den Ergebnissen, die für MDCK-II Zellen erhalten wurden, haften die anderen Zelllinien auch auf nicht beschichteten Sauerstoffsensorfolien ohne die optische Isolierschicht und breiten sich darauf aus. Es bestand kein signifikanter Unterschied in der Zelladhäsion im Vergleich zu Standardzellkulturschalen, wenn die Zellen bis zur Konfluenz gezüchtet wurden. Bei der Kultivierung von Zellen auf beschichteten oder unbeschichteten Sauerstoffsensorfolien wurde jedoch ein geringfügiger Anstieg der Anzahl an toten, abgerundeten Zellen beobachtet. Dementsprechend bring die Beschichtung von Sensorfolien mit haftungsfördernden Materialien keine wesentliche Verbesserung der Adhäsion oder der Lebensfähigkeit der untersuchten Zellen.

Zelladhäsion auf pH Sensorfolien SF-HP5R

Die pH Sensorfolien SF-HP5R wurden auch als Kultursubstrat mit oder ohne die haftungsfördernden Beschichtungen getestet, die zuvor für die O2 Sensorfolien verwendet wurden. Die Zellen wurden erneut als subkonfluente oder konfluente Zellmonolayer untersucht. Die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen zeigen, dass Zellen an der Oberfläche hafteten und ein Actin-Zytoskelett, mit charakteristischen Merkmalen wie dem sehr prominenten Actingürtel, ausbildeten. Es ließ sich kein signifikanter Unterschied zwischen Kontrolle, beschichteten und unbeschichteten Sensorfolien feststellen. Daher können pH Sensorfolien ohne vorherige Beschichtung mit adhäsionsfördernden Materialien verwendet werden.

Zusammenfassung

Die Sensorfolien SF-RPSu4 und SF-HP5R wurden allgemein auf ihre Biokompatibilität und insbesondere auf die Fähigkeit Zelladhäsion zu fördern getestet. Wenn die üblichen SF-RPSu4 Sauerstoffsensorfolien mit OIW als Kultursubstrat verwendet werden, empfehlen wir die Beschichtung der Sensorfolien mit adhäsionsfördernden Substraten wie Gelatine oder Fibronektin, um das Anhaften und Verteilen der Zellen auf der Sensorfolie zu erleichtern. Wenn die OIW von der sauerstoffempfindlichen Schicht der SF-RPSu4 entfernt wird, ist eine Beschichtung nicht zwingend erforderlich, wie in Experimenten mit MDCK-II, NRK, BAEC oder U-373 Zellen gezeigt wurde. Die pH Sensorfolien SF-HP5R ermöglichen MDCK-II Zellen sich anzuhaften und zu verteilen. Da sich andere Zelllinien, als die in dieser Studie verwendeten, unterschiedlich anhaften und ausbreiten können, empfehlen wir die Verwendung von Serum, serumhaltigem Kulturmedium oder Proteinen wie Fibronektin oder Poly-L-Lysin zur Beschichtung für bessere Adhäsion.

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