Optimierung des Bioprozesses für kultiviertes Fleisch

Das Zellkulturmedium ist der bedeutendste Kostentreiber für die Kulturfleischproduktion. Die Optimierung des Designs und der Instrumentierung von Bioreaktoren durch zusätzliche Überwachungsfunktionen mittels Sensoren kann dazu beitragen, diese Kosten zu senken und eine maximale Zellproduktionskapazität pro Einheit mittleren Volumens zu erreichen.
Scale-Down-Ansätze werden seit langem in der Bioverarbeitung angewendet, um Scale-Up-Probleme zu lösen. Miniaturisierte Bioreaktoren haben sich als Instrument zur Gewinnung prozessrelevanter Daten in der frühen Prozessentwicklung bewährt. Wir haben dieses Prinzip , d. h. den "Lab-on-a-Chip"-Ansatz (LoC) bei der Entwicklung einer neuen Generation kostengünstiger Sensoren zur Überwachung verschiedener Zellkulturparameter wie Biomasse, Ammoniak und Glutamin in Zellkulturmedien angewendet.
Wir haben unsere maßgeschneiderten mikrofluidischen Bioreaktoren verwendet, die mit unserem impedimetrischen Sensor und einem optischen Sensor in Kombination mit den von PreSens bereitgestellten SensorPlugs für O₂, CO₂ und pH ergänzt wurden. Die Hauptidee unseres Projekts war es, herauszufinden, welche Prozesse im mikrofluidischen Bioreaktor ablaufen, und die Auswirkungen auf das Zellverhalten, die Lebensfähigkeit der Zellen und die Wirksamkeit der Reagenzien zu quantifizieren. Wir haben die Wirksamkeit von PreSens SensorPlugs zur Überwachung von Bakterien- und Säugetierzellkulturen in mikrofluidischen Bioreaktoren getestet. Darüber hinaus führten wir eine Reihe von Pilotversuchen mit menschlichem Speichel durch, um die Anwendung der Sensoren zur Geschmacksbewertung des Endprodukts des kultivierten Fleisch-Bioprozesses weiter auszubauen. Hier werden unsere Ergebnisse für die Überwachung der Bakterienkultur gezeigt.

Die mehrschichtigen MB-Chips wurden aus den transparenten und biokompatiblen Materialien Glas und PMMA hergestellt. Die obere und die mittlere Schicht bestanden aus PMMA und die Verbindungsschichten wurden unter Verwendung von doppelseitigen 3M-Klebebändern (3M GPT-020F, St. Paul, MN 55144-1000, Minneapolis, USA) hergestellt. Die untere Schicht des Chips für die Zellkultur bestand aus Glas, auf die der Impedanzsensor mit dem piezokontrollierten Tintenstrahldruckers Fuji Dimatix DMP-3000 und der handelsüblichen Agfa-Gevaert N.V.-Nanosilbertinte mit 15 % Ag-Nanopartikeln und der leitfähigen Tinte gedruckt wurde. Der Sensor wurde mit einer dünnen Schicht SU-8 3000 Microchem Resist bedeckt. Die oberste Schicht enthielt Einlass- / Auslasslöcher, deren Durchmesser zum Pipettieren der Probe während des Füllens des Chips angepasst waren. Zusätzlich wurden drei Löcher mit einem Durchmesser von 2,1 mm in die oberste Schicht zur Montage der PreSens SensorPlugs gemacht. Die Sensoren standen durch die Löcher in direktem Kontakt mit der Probe, was eine Echtzeitmessung der Parameter in der Probe ermöglichte. Das in der mittleren Schicht des Chips hergestellte Reservoir hatte ein Volumen von 1,8 mm für die Probe. Eine Übernachtkultur von E. coli wurde durch Aussäen von Bakterien in Trypton-Soja-Brühe hergestellt. Danach wurde eine Übernachtkultur zur Herstellung von 0,5 McFarlan E. coli-Kultur (1,5 × 10 KBE/ml) verwendet, die zur Kultivierung im MB diente. Wir haben den Chip zusammen mit den PreSens Sensoren im mikrobiologischen Inkubator bei 37 ° C belassen (Abb. 1).

Die Messergebnisse von O₂, CO₂ und pH während der Kultivierung von E. coli im Mikrofluidik-Chip sind in Abbildung 2 dargestellt. pH-Messungen (Abb. 2a) ergaben erwartete Ergebnisse während der Kultivierung von E. coli für 3 Stunden. Nach der anfänglichen Lagphase treten Bakterien in eine exponentielle Wachstumsphase ein, die durch die Zellverdopplungsrate, d. h. die Generationszeit, gekennzeichnet ist. Die Generationszeiten für E. coli-Bakterien variieren im Labor zwischen 15 - 20 Minuten bis hin zu 40 Minuten. Daher wurde die Konzentration von E. coli-Bakterien zu Beginn und am Ende der Experimente unter Verwendung eines Hämozytometers bestimmt. Abbildung 3 zeigt eine Vergrößerung des Hämozytometers, das Quadrat, in dem die Zelleinheiten gezählt werden. 10 µl wurden mit einer Mikropipette gewogen und auf ein Hämozytometer gegeben. Wenn die Gesamtzahl der Zelleinheiten in allen Quadraten gezählt wurde, wurde der Mittelwert berechnet und die Gesamtkonzentration auf dem Chip bestimmt. Das Zählen der Bakterien wurde unter Verwendung eines optischen Mikroskops durchgeführt. Die Anzahl der Bakterien stieg fast um das 13-fache. Abbildung 2 zeigt, dass der anfängliche pH-Wert (als wir die Bakterienkultur innerhalb des Mikrofluidik-Chips ausgesät haben) bei t = 0 min etwa 7,3 betrug. Nach drei Stunden beobachteten wir eine Ansäuerung der Bakterienkultur (pH ~ 6,8), eine Zunahme von % CO₂ und eine gleichzeitige Abnahme von% O₂ während der Inkubation. Die Grafiken zeigen den erwarteten charakteristischen Verlauf des Wachstums von E. coli. In der ersten Lagphase (~ 1,5 h) gab es keine signifikanten Änderungen des pH- und -CO₂ Wertes. Während dieser Phase wurde Sauerstoff verbraucht. Nach ~ 1,5 h stieg der CO₂-Gehalt exponentiell an und O₂ nahm ab. In dieser Phase wurde das TBS-Medium verbraucht und die Zellen traten in die logarithmische Wachstumsphase ein. Der Sauerstoff nahm mit zunehmender Zellzahl ab und fiel während des Experiments auf Null. Dies zeigt sich auch in einem Anstieg des CO₂. Aufgrund des begrenzten Sauerstoffgehalts konnten E. coli nicht mehr im Mikrofluidik-Chip wachsen und der Prozess ging in die stationäre Phase über. Nach 3 h fiel der O₂-Gehalt auf 3 %, während der CO₂-Gehalt auf 4 % anstieg. Die Sensoren zur Überwachung der mikrobiellen Kultur zeigten umfassende Ergebnisse und ermöglichten eine genaue Beurteilung des aktuellen Kulturstatus.

Basierend auf den vorgestellten Ergebnissen können wir den Schluss ziehen, dass die PreSens SensorPlugs eine bequeme Möglichkeit sind, grundlegende Parameter (O₂, pH, CO₂) in der mikrofluidischen Bakterienkultur zu überwachen. PreSens SensorPlugs sind wichtig für die Analyse des Scale-Down-Ansatzes und die Prozessüberwachung bei der Optimierung kultivierter Bioprozesse. Zukünftige Experimente werden auf die kontinuierliche Überwachung und Optimierung des Kultivierungsprozesses gerichtet sein und die Auswirkungen von ätherischen Ölen und Antibiotika auf verschiedene antibakterielle und antimykotische Aktivitäten in Mikrobioreaktoren untersuchen. Die Forschung konzentriert sich auf die Ermittlung der Korrelation zwischen den Messwerten von pH-, O₂- und CO₂-Sensoren mit zusätzlichen Sensoren (impedimetrisch, optisch und elektrochemisch), die in mikrofluidische Bioreaktoren integriert sind, die wir am Institut zur Messung der Leitfähigkeit des Mediums, von Metaboliten oder der Biomasse entwickelt haben.