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Echtzeit-Respirationsmessungen

Messungen der aeroben Atmung komplexer mikrobieller Gemeinschaften

B. R. Roller1, Z. M. Lee1, K. E. Studer-Rabeler2, und T. M. Schmidt1
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Dept. of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, East Lansing, MI, USA
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Coy Laboratory Products, Grass Lake, MI, USA

Viele Methoden zur Messung der aeroben Atmung, einschließlich Elektroden und kolorimetrischer Tests, bieten nur eingeschränkte Möglichkeiten etwa Replikationsmessungen durchzuführen oder den Sauerstoffverbrauch in Echtzeit zu erfassen. Das OxoDish® - eine Mikrotiterplatte mit integrierten Sauerstoffsensoren - und der SDR SensorDish® Reader bieten die Möglichkeit, gleichzeitig vierundzwanzig Respirationsmessungen in Echtzeit durchzuführen. Ökologen, die die Atmung komplexer mikrobieller Gemeinschaften untersuchen, können davon profitieren.

Unser Ziel war die Optimierung des SDR OxoDish®-Systems zur Messung des Sauerstoffverbrauchs in Bakterien-Reinkulturen und in Bodenschlämmen mit komplexen mikrobiellen Gemeinschaften. Bodenschlämme sind besonders herausfordernd, da sich Bodenpartikel auf der Optode absetzen können. Zwei Modifikationen des OxoDish® waren nötig, um den O2-Verbrauch für diese Proben genau zu messen: den O2-Eintrags in die Wells der Mikrotiterplatte zu minimieren und die Lösung gut zu mischen, so dass der O2-Verbrauch in der gesamten Tiefe des Wells homogen war. Eine Reinkultur des Pseudomonas Stammes HF3 und Waldboden wurde verwendet, um die Modifikationen am OxoDish® zu testen.

Material & Methoden

Der O2-Eintrag in mit Klebefolie bedeckte Wells wurde experimentell bestimmt. Ein Wachstumsmedium, das Resazurin, einen kolorimetrischen Indikator für O2, und Cystein, ein Reduktionsmittel das O2 verbraucht, enthielt wurde unter anaeroben Bedingungen in einer Vinylkammer / Glovebox in 12 Vertiefungen eines OxoDish® gegeben. Die Wells wurden so voll wie möglich gemacht, und die Hälfte der Vertiefungen mit Klebefolie bedeckt. Das OxoDish® wurde bei Umgebungssauerstoffatmosphäre bei 25 °C und 100 U/min auf einem Rotationsschüttler inkubiert, und die abgedeckten mit den unbedeckten Wells verglichen. Mit einem sterilen Wachstumsmedium als Negativkontrolle wurde die Wirkung von Glaskügelchen auf den O2-Verbrauch getestet. Diese wurden verwendet, um das Mischen durch Rotationsschütteln weiter zu fördern. Proben des Pseudomonas Stammes HF3 wurden aus einer angeglichenen Wachstumskultur entfernt und in sechs OxoDish® Wells gegeben, von denen die Hälfte 2 sterilisierte Glaskügelchen pro Vertiefung enthielt und mit Klebefolie bedeckt war (Abb. 1). In 120-minütigen Experimenten bei 25 °C und 100 U/min, wurde die O2-Konzentration alle 15 Sekunden in jedem Well gemessen. Bei allen Ratenmessungen wurden die ersten 5 Minuten der gesammelten Daten verworfen, um die Äquilibrierungszeit zu berücksichtigen. Die Perlen- und Folienmodifikationen des OxoDish® wurden dann für Bodenschlammproben eingesetzt. Waldboden wurde gesiebt (2 mm) und 1 : 1 (w : v) in 10 mM MES-Puffer (pH 6), ergänzt mit 50 µg/ml Cycloheximid und 2,3 mM Natriumpyrophosphat, resuspendiert. Die Bodenaufschlämmung wurde 30 Minuten lang gerührt, durch 8 Lagen Seihtuch filtriert und für unterschiedliche Partikelbeladung durch ein 100 µm- oder 40 µm-Zellsieb gesiebt. Die Aufschlämmung wurde dann in Wells mit zwei sterilen Glaskügelchen gegeben, wie für reine Kulturversuche beschrieben, und steriler Puffer wurde als negative Kontrolle verwendet.

Sauerstoffeintrag

Wells, die steriles anaerobes Medium enthielten und mit Klebefolie bedeckt waren, wiesen für mehr als 120 Minuten keinen nachweisbaren O2-Eintrag auf, während unbedeckte Wells nach 40 Minuten in Umgebungsatmosphäre unter Schütteln mit 100 U/min O2-Eintrag zeigten (Abb. 2). Die 40-minütige Verzögerung bei der SDR-Detektion des O2-Zuflusses in unbedeckten Wells kann darauf zurückgeführt werden, dass Cystein sämtlichen Sauerstoff verbrauchte, der in das Medium diffundierte. Resazurin bestätigte die SDR-Werte, wobei sich die 6 unbedeckten Wells innerhalb von Minuten nach Entfernen aus der anaeroben Umgebung rosa verfärbten, was auf einen O2-Eintrag hinwies. Fünf der sechs abgedeckten Vertiefungen blieben jedoch klar, was zeigte, dass über viele Stunden kein Sauerstoffeintrag stattfand.

Sauerstoffverbrauch reiner Kulturen

Im zweiten Experiment wurde die Atmung des Pseudomonas Stammes HF3 und die Wirkung des Mischens mit Glaskügelchen gemessen. Der bakterielle O2-Verbrauch in Wells, die mit Kügelchen gemischt wurden, war weniger variabel als in Wells ohne Kügelchen, was auf eine homogenere Lösung in der gesamten Tiefe des Wells zurückzuführen ist (Abb. 3). Mit linearer Regression wurde die mittlere O2-Verbrauchsrate für Proben mit Glaskügelchen auf 5,74 nmol/min berechnet, und die Replikate hatten einen Variationskoeffizienten (c. V.) von 6,7 %. Die mittlere Rate für Proben ohne Kügelchen betrug 11,86 nmol/min (c. V. = 18,9 %). Die O2-Verbrauchsraten wurden nicht um den O2-Eintrag korrigiert, aber sie sind für Vergleiche der Variabilität bei unterschiedlichen Behandlungen geeignet. Zellen, die sich auf der Optode absetzten, hatten keinen nachweisbaren Einfluss auf die Messungen, wenn die Kulturen mit Kügelchen gerührt wurden, da sich die Geschwindigkeit des O2-Verbrauchs nach einer Verdopplungszeit der reinen Kulturpopulation verdoppelte (Daten nicht gezeigt). Dies weist darauf hin, dass die Lösung homogen war und keine Veränderung des Wachstums auftrat, wenn die Bakterien von einem Kolben in ein verschlossenes OxoDish®-Well überführt wurden. Die spezifische O2-Verbrauchsrate mit Kügelchen (Mittelwert 2,0 × 10-7) ist zwar nicht auf O2-Eintrag korrigiert, ist jedoch ähnlich der Rate, die mit Mikrorespirometrie gemessen wurde (Mittelwert 3,4 × 10-7).

Sauerstoffverbrauch von Bodenschlamm

Die Glaskugel- und Folienmodifikationen des OxoDish® wurden dann für eine komplexe mikrobielle Gemeinschaft verwendet. Die O2-Verbrauchsraten wurden für eine Bodenaufschlämmung gemessen, die durch zwei unterschiedlich große Zellsiebe für unterschiedliche Teilchenbeladungen filtriert wurde. Der größte Unterschied zwischen den beiden Ansätzen mit unterschiedlicher Partikelbeladung bestand in der Variabilität der Messung, wobei die 40μm-gesiebten Proben einen Variationskoeffizienten für die mittlere O2-Verbrauchsrate von 7,08 % aufwiesen, was viel kleiner ist als der Variationskoeffizient der 100μm-gesiebten Proben mit 35,05 % (Abb. 4). Die Abnahme der Variabilität für 40μm-gesiebte Proben wird auf eine erhöhte Homogenisierung der Bodenaufschlämmung im Well zurückgeführt, wogegen die 100μm-gesiebten Proben zu viele Partikel enthielten, die sich absetzen.

Zusammenfassung

Der SDR zusammen mit dem OxoDish® ist für Studien in der mikrobiellen Ökologie sehr nützlich, da sich leicht Replikations- und Echtzeitmessungen durchführen lassen. Das OxoDish® kann mit einer Klebefolie modifiziert werden, um den O2-Eintrag in die Wells der Mikrotiterplatte zu minimieren. Mit Glaskügelchen lässt sich in der gesamten Tiefe eines Wells eine homogene Lösung erzeugen. In zukünftigen Untersuchungen komplexer mikrobieller Gemeinschaften können mit dem SDR und OxoDish® der O2-Verbrauch gemessen und gleichzeitig mehrere Variablen manipuliert werden, wobei eine große Replikationskapazität erforderlich sein wird.

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