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Integration chemisch-optischer pH- und Sauerstoffsensoren in bestehende Steuergeräte

Kultivierungsüberwachung in einem Glasbioreaktorsystem mit nachträglich integrierten Sensorspots

Cedric Schirmer1, Vivian Ott1, Gernot T. John2, Dieter Eibl1
1Züricher Hochschule für Angewandte Wissenschaften, School of Life Sciences and Facility Management, Institut für Chemie und Biotechnologie, Wädenswil, Schweiz
2PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Deutschland

Der Einsatz chemisch-optischer Sensoren zur Kultivierungsüberwachung in Bioreaktoren mit einer bereits vorhandenen Steuereinheit erfordert die Eingabe zusätzlicher Messsignale. Zu diesem Zweck muss das digitale Signal oft in ein analoges Signal umgewandelt werden. Dies erreicht man, indem man die Online-Messdaten der Sensoren für pH und gelösten Sauerstoff (DO) mit der Software PreSens Measurement Studio 2 erfasst, über einen Complementary Straight Binary Converter (CSB) konvertiert und an die Steuereinheit überträgt. Die an die Steuereinheit gesendeten Signale können dann zur Überwachung und Steuerung von pH- und DO-Profilen verwendet werden. Die genaue und korrekte Funktionsweise des Versuchsaufbaus konnte in Versuchen mit Chinese Hamster Ovary (CHO) und Escherichia coli Zellen überprüft werden und sollte auch in Kombination mit anderen Bioreaktorsystemen und Steuergeräten verschiedener Hersteller einsetzbar sein.

Chemisch-optische Sensoren ermöglichen eine nicht-invasive Überwachung des Sauerstoffgehalts und des pH-Wertes in Bioreaktoren und haben sich in den letzten Jahren in Einwegsystemen bewährt. Wenn die Sensorspots einem durch Polymerfasern übertragenen Lichtsignal ausgesetzt sind, wird ein Messsignal erzeugt, das von der entsprechenden Software in digitaler Form ausgewertet werden kann. Viele Steuergeräte sind immer noch für den Betrieb mit herkömmlichen elektrochemischen Sonden ausgelegt. Um die chemisch-optischen Sensoren für die Kultivierungsüberwachung einsetzen zu können, bietet PreSens OEM-Lösungen wie Elektrooptische Module (EOM) und Standalone-Lösungen für die Sauerstoff- und pH-Messung an, die in Steuergeräte integriert werden können. Die Systeme können an einen Computer angeschlossen werden, auf dem die PreSens Measurement Studio 2 Software ausgeführt wird. Diese ist leicht zu bedienen und ermöglicht es, die Sensorspot-Signale zu kalibrieren und auszulesen, und Messdaten aufzuzeichnen. Durch die Verwendung einer Softwareerweiterung und Integration eines 2-Kanal-CSB-Wandlers kann das digitale Messsignal in analoger Form an ein Universalsteuergerät mit verfügbaren analogen Eingängen übertragen werden. Dieser Versuchsaufbau wurde durch Kultivierung mit E. coli (Daten nicht gezeigt) und CHO-Zellen verifiziert.

Material & Methoden

Versuchsaufbau

Der in Abbildung 2 gezeigte Versuchsaufbau wurde verwendet, um die Sensorspot-Signale an die Steuereinheit zu übertragen. Im ersten Schritt wurden der pH-Spot (SP-LG1-SA) und DO-Spot (SP-PSt3-YAU) im unteren Teil des gerührten Glasbioreaktors an der Innenwand angebracht. Polymerfaserkabel wurden von außen über die Glasbioreaktorwand indirekt mit den Sensoren verbunden (1). Um Messsignale zu generieren und zu übertragen, wurden ein EOM-pH-LG1-mini und das Standalone-Gerät Fibox 4 (beide von PreSens, Deutschland) und die anderen Enden der mit den Sensoren verbundenen Polymerfaserkabel gekoppelt (2). Die von EOM-pH-LG1-mini und Fibox 4 erfassten Messsignale wurden über eine USB-Schnittstelle an einen Computer übertragen, auf dem die Software PreSens Measurement Studio 2 ausgeführt wurde (3). Die Software wurde verwendet, um die Daten in einem Intervall von 30 Sekunden (einstellbar in einem Bereich von 1 Sek. bis zu mehreren Stunden) zu sammeln und aufzuzeichnen und die Sensorspots zu kalibrieren. Zur Umwandlung der digitalen Signale wurde zusätzlich ein 2-Kanal-CSB-Wandler (PreSens, Deutschland) über USB mit dem Computer verbunden (4). Zu diesem Zweck wurden in der PreSens Measurement Studio 2 Software den einzelnen Sensoren Ausganskanäle zugeordnet, um die Datenübertragung auf den jeweiligen Kanal des 2-Kanal-CSB-Wandlers zu gewährleisten. Die analogen Signale im Bereich von 4 bis 20 mA, die am jeweiligen Ausgangskanal des CSB-Wandlers zur Verfügung standen, wurden an die analogen Eingänge des Steuergerätes (KLF, Bioengineering, Schweiz) weitergeleitet und zur Prozesskontrolle von pH und DO verwendet.

CHO-Zellkultur

Die CHO-Zellkultivierung wurde mit der CHO-Zelllinie XM111-10 (CCOS Nr. 837) durchgeführt. Diese Zelllinie hat einen Tetracyclin-regulierten Promotor, der die Expression des sekretierten alkalischen Phosphatase-Gens (SEAP-Gen) reguliert, das für die sekretorische alkalische Phosphatase kodiert [1]. Bei den durchgeführten Experimenten lag der Schwerpunkt auf der Massenvermehrung im Batch-Modus, so dass die Synthese von SEAP durch Ergänzung des ChoMaster® HP-1-Mediums (Cell Culture Technologies, Schweiz) mit 2,5 mg l-1  Tetracyclin verhindert wurde. Weiterhin wurden dem Medium 0,2 % Pluronic F-68 zugesetzt. Der Bioreaktor wurde mit einer lebensfähigen Zelldichte von 0,5 × 106 Zellen ml-1 bei einem Kulturvolumen von 600 ml inokuliert und bei 37 ° C mit 0,44 vvm Oberflächenbelüftung (Prozessluft) kultiviert. Um einen Sauerstoffgehalt von ≥ 40 % und einen pH-Wert von ≤ 7,2 aufrechtzuerhalten, wurden Sauerstoff und CO2 nach Bedarf zugeführt. Während des 4-tägigen Kultivierungszeitraums wurde alle 12 Stunden eine Probe entnommen, um das Zellwachstum zu bestimmen. Darüber hinaus wurde der pH-Wert bei jeder Probenahme extern gemessen und gegebenenfalls neu kalibriert.

Kultivierungsergebnisse

Abbildung 3A zeigt ein Beispiel für die Entwicklung der lebensfähigen Zelldichte während einer CHO-Zellkultivierung. Bei einer anfänglichen Inokulation von 0,4 · 106 Zellen ml-1 wurde nach einer 3-tägigen Kultivierungsperiode eine maximale Zelldichte von 3,6 · 106 Zellen ml-1 erreicht, was mit früheren Ergebnissen vergleichbar ist [2]. Innerhalb der ersten 1,5 Kultivierungstage wurde eine exponentielle Wachstumsphase mit einer spezifischen Wachstumsrate von 0,042 h-1 beobachtet. Die resultierenden pH-Schwankungen zwischen 7,08 und 7,25 während dieses Zeitraums (Abb. 3B) waren auf das Fehlen eines geeigneten CO2-Massendurchflussreglers in Verbindung mit dem 30-Sekunden-Messintervall des chemisch-optischen Sensorspots zurückzuführen. Die anschließende Abnahme des pH-Wertes, die bis zum 2. Tag andauerte, und die darauf folgende Zunahme bis zum 2,6 Tag verliefen erwartungsgemäß durch Laktatbildung und Katabolisierung. Danach wurde der pH-Wert bis zum Ende der Kultivierung zwischen 6,87 und 7,25 gehalten, wobei der große Schwankungsbereich auf die oben genannten Gründe zurückzuführen ist. Der DO schwankte während der gesamten Kultivierung zwischen 30 % und 45 %. Wie erwartet verringerte sich die Lebensfähigkeit ab dem 3. Tag von 96 % auf 2 % aufgrund der Abnahme von Glucose und Lactat, woraufhin die Kultivierung am 4. Tag beendet wurde.

Zusammenfassung

Die Integration chemisch-optischer pH- und Sauerstoff-Sensorspots in eine bestehende Kontrolleinheit wurde mit CHO-Zellen in einem gerührten Bioreaktorsystem erfolgreich evaluiert. Der Versuchsaufbau, bestehend aus einem EOM-pH-LG1-mini-Modul und dem Standalone-System Fibox 4 in Kombination mit der Software PreSens Measurement Studio 2 und einem 2-Kanal-CSB-Wandler zur Prozesssteuerung, lieferte präzise Messungen während der Untersuchungen. Während des gesamten Testzeitraums konnten keine funktionellen oder technischen Probleme festgestellt werden. Die Integration und Konfiguration des Versuchsaufbaus erfolgte innerhalb weniger Minuten und ist für den Einbau in verschiedene handelsübliche Bioreaktorsysteme und Steuergerätekombinationen geeignet. Es ist erwähnenswert, dass der verwendete Ansatz nicht nur für CHO-Zellen, sondern auch für E. coli-Zellen funktioniert (Daten nicht gezeigt).

Referenzen

[1] Mazur X, Fussenegger M, Renner WA, Bailey JE. Higher Productivity of Growth-Arrested Chinese Hamster Ovary Cells Expressing the Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p27. Biotechnol Prog 1998;14:705–13. doi:10.1021/bp980062h.
[2] Schirmer C, Nussbaumer T, Schöb R, Pörtner R, Eibl R, Eibl D. Development, Engineering and Biological Characterization of Stirred Tank Bioreactors. In: Yeh M-K, Chen Y-C, editors. Biopharmaceuticals, InTech; 2018, p. 87–108. doi:10.5772/intechopen.79444.

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