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Messung der O2-Verbrauchsraten von Blättern mit dem SDR® SensorDish Reader

Angepasster SDR Aufbau mit Probenröhrchen und O2 Sensor Spots in den Schraubkappen

Brendan O'Leary
ARC Centre for Plant Energy Biology, The University of Western Australia, Perth, Australien

Ich habe getestet, ob der Einfluss externer Metaboliten auf die O2-Verbrauchsraten von Blättern mit dem SDR gemessen werden kann. Insbesondere wurde zuvor in einem Screening von Metaboliteneffekten auf die O2-Verbrauchsrate von Blättern (unter Verwendung von Q2 von Astec Global) beobachtet, dass 10 mM Prolin (Pro) eine ungefähr zweifache Stimulation der Atemfrequenz über 14 Stunden bewirkt. Die Hauptaspekte dieser Messung sind ihre Dauer (> 14 Std.) und ihre dynamische Natur, da wir daran interessiert sind festzustellen, wie sich die Raten im Laufe der Zeit ändern. Ich habe den SDR-Aufbau angepasst, so daß der Sauerstoff im Kopfraum der Röhrchen mit den Proben gemessen werden kann.

Hintergrund: Bedarf an Messtechniken zur Bestimmung der Pflanzenrespiration

Atemfluss und Photosyntheserate sind die einzigen Stoffwechselflussmessungen, die routinemäßig in Pflanzen angewendet werden können, und beide sind daher entscheidende Werkzeuge für das Verständnis der Pflanzenbiochemie und -physiologie. Derzeit gibt es verschiedene Technologien, mit denen die Atemgas-Austauschraten von Pflanzen gemessen werden können, z. B. Infrarot-Gasanalysatoren für CO2 und O2-Elektroden vom Clark-Typ für Sauerstoff. Beide Technologien lassen Messungen mit nur geringem Durchsatz und von kurzer Dauer zu, was experimentelle Designs in großem Maßstab behindert, wie sie beispielsweise für Pflanzenzüchter von Nutzen wären. Das Australia Research Council Center of Excellence in Plant Energy Biology (PEB) ist führend in der Entwicklung und Erprobung neuer Technologien zur Atmungsmessung für den Einsatz an Pflanzen. Insbesondere wurde die Verwendung der O2-abhängigen Fluoreszenzlöschung in verschiedene Hochdurchsatztechnologien wie dem SDR SensorDish® Reader, dem Seahorse oder dem Q2 von Astec Global übernommen. Der Einsatz dieser Technologien in der Pflanzenwissenschaft ist jedoch nicht weit verbreitet, und insbesondere das Seahorse kann nur begrenzt eingesetzt werden, wenn schwimmendes Pflanzengewebe untersucht werden soll [1]. Obwohl wir Standard-SDRs in Kombination mit zuvor verfügbaren Glasplatten mit Sensor Spots ausprobiert haben, war die Position der Spots am Boden der Vertiefungen nicht mit Messungen mit Flüssigkeiten und einem Headspace kompatibel. Ein Großteil der Atmungsforschung bei PEB stützt sich derzeit auf das Q2. Diese Maschine verwendet im Wesentlichen eine eigene Version von Sensor Spots, die in den Kappen von Schraubröhrchen angebracht sind, und einen Robotersensorarm. Das Q2 funktioniert insgesamt gut mit verschiedenen Pflanzengeweben und stellt eine große Verbesserung der Messkapazität dar, wie in Scafaro et al., 2017 [2] beschrieben. Der einfache Aufbau mit Röhrchen und Schraubkappen ist auch für Messungen mit flüssigen Medien geeignet. Dies ist ein großer Vorteil, da dadurch Chemikalien in die Atmungstests eingeführt werden können, wodurch die Nützlichkeit erheblich erweitert wird [3]. Daher wollte ich testen, ob der SDR mit Röhrchen und Sensor Spots in den Schraubkappen an einen ähnlichen Aufbau wie dem des Q2 angepasst werden kann, und ob er überlegene Messeigenschaften besitzt.

Material & Methoden

Der Versuchsaufbau war einfach und schnell (Abb. 1). Kunststoff-Schraubkappenröhrchen mit einer Gesamtkapazität von 856 µl wurden mit 600 µl gepufferter Lösung (50 mM HEPES, 10 mM MES, 200 µM CaCl2, pH 6,6) in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 mM Pro (oder einer anderen Chemikalie, je nach Bedarf) befüllt, so dass ein Luftraum von 256 µl Luft verbleibt. Blattscheiben mit 7 mm Durchmesser wurden ausgestanzt, auf der Lösung schwimmend platziert, und die Röhrchen verschlossen (n = 10). In allen Tests sollten Blindröhrchen ohne Blattscheiben für jede Behandlung enthalten sein, da sie erforderlich sind, um erhebliche Hintergrundgeräusche zu entfernen und die Datenqualität zu verbessern. Der SDR wurde dann mit zwei 3D-gedruckten Adaptern (PreSens) zusammengebaut. Der Aufbau dauert ungefähr 15 Minuten für einen SDR. Die mitgelieferten Kappen und Röhrchen waren von hoher Qualität. Die Montage des Geräts war angesichts des minimalen Designs der Adapter recht robust. Sauerstoffdaten wurden im Dunkeln bei Raumtemperatur gesammelt. Der Assay wurde über Nacht (~ 17 Std.) in Intervallen von 15 s durchgeführt. Die Daten wurden zur Analyse nach Excel exportiert. Das gesamte Experiment wurde dreimal wiederholt und jedes Mal wurden die gleichen Ergebnisse erzielt.

Ergebnisse

Abbildung 2 zeigt mit dem SDR aufgezeichnete Sauerstoffmessungen aus einem Experiment, bei dem unbehandelte mit Pro-behandelten Blattscheiben verglichen wurden. Diese Werte wurden für weitere Verbrauchsratenberechnungen verwendet. Ich habe die O2-Verbrauchsrate über die Zeit korrigiert, indem ich die Durchschnittsraten in Blindröhrchen ohne Blattscheiben abgezogen habe. Die Raten wurden dann als sich bewegendes 1,5-Stunden-Fenster berechnet (Abb. 3A - B). Die Glätte der O2-Verbrauchsraten-Kurven über die Zeit ist eine Funktion des Zeitfensters, das zur Berechnung der sich bewegenden Steigung verwendet wird: Ein größeres Fenster entspricht einer glatteren Kurve. Für den Zweck dieses Experiments ist das nach der Blindsubtraktion verbleibende Rauschen jedoch kein Faktor. O2-Prozentsätze wurden nach Scafaro et al. 2017 [2] in Molwerte umgerechnet.

Die Ergebnisse zeigen, dass der SDR-Aufbau in Verbindung mit den Röhrchen und Kappen die vorherigen Ergebnisse reproduziert, die mit dem Q2 erhalten wurden. Die O2-Verbrauchsrate nahm bei Kontrollblattscheiben im Laufe der Zeit allmählich ab (Fig. 3A, C). In den mit Pro behandelten Scheiben stieg die O2-Verbrauchsrate im Laufe der Zeit ab 4 Stunden nach der Inkubation wie erwartet an (Fig. 3B, C, D). In Abbildung 3D haben wir zwei verschiedene Arabidopsis-Genotypen verglichen. In diesem Assay war es möglich, bereist früher beobachtete phänotypische Unterschiede der verschiedenen Linien hinsichtlich ihrer Reaktion auf externes Pro unter Verwendung von sechs Replikaten festzustellen.

Datenqualität

Der Schlüsselfaktor sind technische Unterschiede bei den Messungen. Die Replikatkurven für Kontrollbehandlungen zeigten im Vergleich zu anderen Respirationsmessgeräten geringere technische Varianz: Der Varianzkoeffizient betrug 22,7 % (und dies schließt die biologische Varianz ein, sodass die zugrunde liegende technische Varianz noch geringer war). Dieser niedrige Koeffizient ist entscheidend, da es einfacher ist, Unterschiede zwischen Probentypen mit entsprechender Anzahl an Replikaten zu bestimmen. Die größeren Unterschiede in den O2-Verbrauchsraten bei mit Pro behandelten Blattscheiben war erwartet worden, da die Reaktion auf Pro aufgrund der biologischen Unterschiede der Blattscheiben weniger gleichmäßig ist.
Die Messfrequenz von 15 s war mehr als ausreichend, um zeitabhängige Muster in den Daten aufzulösen. Die Möglichkeit, die Temperaturen durch Aufstellen des Geräts in Inkubatoren zu steuern, ist ein weiterer Vorteil für die Pflanzenatmungsforschung.

Abb. 3: Tests der O2-Verbrauchsraten in Blattscheiben bei Exposition gegenüber exogenen Chemikalien. Arabidopsis-Blattscheiben wurden mit oder ohne 10 mM Pro inkubiert und die O2-Abnahmeraten im Dunkeln über etwa 15 Stunden gemessen. Die Raten wurden korrigiert, indem die durchschnittliche Rate von vier Röhrchen, die Puffer, aber keine Blattscheiben enthielten, subtrahiert wurde. (A, B) Einzelne Kurven für Kontroll- und Pro-behandelte WT-Blattscheiben (n = 10). (C) Gemittelte Kurven von A und B. (D) Gemittelte Kurven der Pro- und Kontrollbehandlungen von WT und einer Mutantenlinie, gezeigt relativ zu unbehandelten WT-Raten (n = 6). Die Mutantenlinie zeigt einen teilweisen Mangel an Atemstimulation durch Pro.

Referenzen
[1] Sew YS, Ströher E, Holzmann C, Huang S, Taylor NL, Jordana X, Millar AH. 2013. Multiplex micro-respiratory measurements of Arabidopsis tissues. New Phytologist 200: 922-32.
[2] Scafaro AP, Negrini ACA, O'Leary B, Rashid FAA, Hayes L, Fan Y, Zhang Y, Chochois V, Badger MR, Millar AH, et al. 2017. The combination of gas-phase fluorophore technology and automation to enable high-throughput analysis of plant respiration. Plant Methods 13: 16.
[3] O'Leary BM, Oh GGK, Lee CP, Millar AH. 2019. Metabolite regulatory interactions control plant respiratory metabolism via Target of Rapamycin (TOR) kinase activation. The Plant Cell 32: 666-682.

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