O₂, CO₂ und pH Dynamiken im Kapillarsaum

VisiSens™ kombiniert mit einem automatisierten linearen Positionierungssystem liefert vollständige Analytkarten

Wir untersuchten das biochemische Transformationspotential im Kapillarsaum (CF) durch Messung der Verteilung gelöster Gase und des pH-Wertes. Dafür haben wir die VisiSens™ A1, A2 und A3 mit einem linearen Positionierungssystem kombiniert, um die Detektoreinheiten in einem Laborexperiment entlang des CF zu bewegen. Mit diesem Aufbau erhielten wir vollständige Bilder der Analytverteilung im CF und die Bilder bestätigten, dass der CF optimale Bedingungen für eine hohe biologische Aktivität und biochemische Umwandlung von organischen Verbindungen bietet.

Im Labor wurde eine sogenannte Hele-Shaw-Zelle aufgebaut. Sie war mit Sand gefüllt (Höhe = 20 cm), der ein realitätsnahes Bodensystem mit Abmessungen von 80 x 30 x 5 cm³ nachahmte (Abb. 1A). Zur Integration der Zelle in den Messaufbau wurden Item Aluminiumprofile (Item Industrietechnik GmbH, Solingen, Deutschland) verwendet. Das lineare Positionierungssystem (igus GmbH, Köln, Deutschland) ermöglichte die gesteuerte Bewegung eines Kameraschlittens entlang jedes Sensorstreifens, der innen an der Glaswand der Hele-Shaw-Zelle angebracht war. Die igus-Komponenten wurden an den Item-Profilen montiert. Es wurden fünf Zonen (A - E, 1A) definiert, die einen Sensorstreifen von 20 × 2 cm² für O₂, CO₂ und pH (PreSens GmbH, Deutschland) enthielten. Salicylsäure wurde als organische Modellverbindung verwendet, die im CF abgebaut werden sollte. Das Kultivierungsmedium zusammen mit Nährstoffen wurde in einer Höhe von 10 cm in die Zelle gepumpt. Das System wurde unter Verwendung einer Stammkultur von Pseudomonas fluorescence (7 × 10⁷ Zellen/ml) inokuliert. Dadurch entwickelte sich der CF in verschiedenen Höhen entlang der Hele-Shaw-Zelle. Das igus-System verwendet Schrittmotoren für die Bewegung. Ihre Kontrolle wurde mit einem hauseigenen Stepper Driver Shield (bestückt mit Schrittmotortreibern Pololu DRV8825) an einem Arduino Uno R3 realisiert. Der Arduino wurde mit der grbl-Firmware (http://bengler.no/gbrl, Version 0.8 mit einem angepassten Referenzcode, der mit zwei Achsen arbeitet) geflashed. Kurz gesagt interpretiert grbl den g-Code und wandelt diese Befehle in die Bewegung der Schrittmotoren um. Eine neue Version der VisiSens™ Software (VisiSens AnalytiCal 4) wurde von PreSens entwickelt, die die gleichzeitige Darstellung von drei verschiedenen Analyten (O₂, CO₂ und pH) ermöglicht und von externer Software getriggert werden kann und umgekehrt. Insbesondere wurde ein Python-Skript (www.python.org) entwickelt, das die Bewegung des Kameragehäuses durch Senden von g-Code an das Arduino steuerte. Sobald die Position erreicht und bestätigt wurde, wurde VisiSens™ ausgelöst, um ein Bild des ausgewählten Analyten zu erhalten. Jedes einzelne Bild eines Analyten bedeckt etwa 1,5 × 2 cm² auf einem Sensorstreifen. Um die Verteilung aller drei Analyten über die gesamte Höhe des CF sichtbar zu machen, wurde der Kameraschlitten so bewegt, dass angrenzende Bilder sich um 20% überlappten (1B). Die Bilderfassung begann in der unteren linken Ecke in Zone A in der Reihenfolge pH-Wert -> O₂ -> CO₂. Dann wurde der Kameraschlitten nach oben bewegt, um den nächsten Satz von drei Bildern zu erhalten. Insgesamt wurden 130 Bilder pro Analyt über die Hele-Shaw-Zelle (Zonen A-E) aufgenommen. Die Erfassungszeit betrug etwa 20 Minuten pro Lauf und das System lief über 160 Stunden zuverlässig. Die Bildaufnahme wurde mit der neu entwickelten VisiSens™ Software durchgeführt und die Bildanalyse mit Matlab (MathWorks Inc., Nattick, USA) realisiert. Matlab-Skripte wurden entwickelt, um die Verteilung von O₂, CO₂ und pH-Wert über die gesamte Hele-Shaw-Zelle basierend auf den aufgenommenen Bildern zu interpolieren.

Wie erwähnt, wurde Salicylsäure als Modellverbindung verwendet, um den aeroben Abbau von organischen Substanzen im CF zu untersuchen. In Abb. 2 ist die O₂-Verteilung über die gesamte Hele-Shaw-Zelle aufgetragen. Der obere Teil (20 - 30 cm) ist luftgesättigt und erscheint somit dunkelrot. Der CF selbst entwickelte sich in einer Höhe von 5 - 20 cm. Innerhalb dieser Region lag die O₂ Konzentration bei ca. 70 - 80 % Luftsättigung. Aufgrund des aeroben biochemischen Abbaus von Salicylsäure fiel die O₂-Konzentration in der wassergesättigten Zone ab. Dunkelblaue Bereiche zeigen die Regionen, in denen der Sauerstoff fast vollständig verbraucht wurde (ca. 20 % Luftsättigung). Mit dem VisiSens™ System wurde eine Grenze zwischen der wassergesättigten Zone und des CF visualisiert (grüne und gelbe Region in Abb. 2). Hier kann ein ausgewogenes Verhältnis zwischen Wassergehalt, O₂-Verfügbarkeit und O₂-Verbrauch angenommen werden. Darüber hinaus ermöglichte das vorgestellte System das Extrahieren vollständiger O₂-Profile über die Höhe des CF in den Zonen A - E. Wie in Abbildung 2 gezeigt, zeigen die Profile die Entwicklung von Sauerstoff verbrauchenden Regionen innerhalb des künstlichen Bodensystems. Es kann ferner als ein Bild der Salicylsäureverteilung verstanden werden, die in den Zonen A - B durch die Einströmungseigenschaften und in den Zonen C - E durch die Schwerkraft beeinflusst wurde. Ein Abbauprodukt von Salicylsäure ist CO₂. In Abb. 3 ist ersichtlich, dass CO₂ im CF oberhalb der wassergesättigten Zone gebildet und akkumuliert wurde, in einer Höhe von 8 cm entlang der Zonen A - E (Bereiche in Cyan, Grün und Gelb). Da die pH-Karte (Daten nicht gezeigt) keine Artefakte wie Gasblasen zeigte, ist anzunehmen, dass das CO₂ in der flüssigen Phase gelöst war. Die CO₂-Konzentration erreichte in der Zone A ihr Maximum von 5 %. Hier sollte die biologische Aktivität und das Wachstum hauptsächlich durch das O₂- und salicylsäurereiche Kultivierungsmedium beeinflusst worden sein, das kontinuierlich in einer Höhe von 10 cm in die Hele-Shaw-Zelle gepumpt wurde.

Der CF ist ein hochdynamisches System, das gute Abbaufähigkeiten für organische Verbindungen bietet. Dies ist zum Beispiel bei der Bio-Sanierung von kontaminierten Standorten interessant. Eine Hele-Shaw-Zelle schafft eine recht realistische Anordnung im Labormaßstab, um die Wechselwirkung von organischen Verbindungen mit Mikroorganismen im CF zu untersuchen. Die größte Herausforderung besteht darin, die Aktivität innerhalb des CF in vier Dimensionen zu erfassen. Diese vier Dimensionen (x, y, z, Zeit) wurden durch die Entwicklung eines automatisierten linearen Positionierungssystems in Verbindung mit einer optimierten VisiSens™ Software bewertet. Das System lieferte hochaufgelöste lokale Konzentrationsmessungen für O₂, CO₂ und pH-Wert, was die Approximation der Analytkarten für die gesamte Hele-Shaw-Zelle ermöglichte. Schließlich konnte bestätigt werden, dass der CF optimale Bedingungen für eine hohe biologische Aktivität in einem weiten Bereich von O₂-Verfügbarkeit und O₂-Verbrauch bietet. Darüber hinaus ermöglicht die Integration von O₂- und CO₂-Sensorstreifen die Berechnung von Kohlenstoff-Massenbilanzen.

Danksagung
Die finanzielle Unterstützung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft wird dankbar anerkannt (FR536/39-2; Der dynamische Kapillarsaum - ein multidisziplinärer Denkansatz, Teilprojekt 5, DyCap II).