Tutorials, Webinare und informative Videos über unsere optischen Sensorsysteme
O2-sensitive Mikrokavitätenarrays zur Überwachung von 3D Zellkultur
Sauerstoff-Imaging in Spheroiden mit VisiSens TD Technologie
C. Grün1, G. Liebsch2 und E. Gottwald1
1Institut für Funktionelle Grenzflächen, Karlsruher Institut für Technologie, Karlsruhe, Germany
2PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Germany
Durch Mikrothermoforming wird eine Reihe von Mikrokavitäten in Sauerstoffsensorfolien erzeugt. In diesen Hohlräumen können 3D-Zellaggregate kultiviert und der Sauerstoffgehalt mittels Bildgebung quantifiziert werden. Mit Hilfe dieser neuen Plattformtechnologie ist es nun erstmals möglich, Sauerstoff in der direkten Mikroumgebung von Sphäroiden und Organoiden zu überwachen und damit in vitro nahezu in vivo Bedingungen zu schaffen.
Zellkulturtechnologien sind seit Jahrzehnten ein wertvolles Instrument in der Grundlagenforschung und Arzneimittelentwicklung. In vitro 3D-Kulturen haben im Vergleich zu 2-dimensonalen Kultivierungsansätzen viele Vorteile, da Schlüsselparameter wie z. B. Zellverhalten, Stoffwechsel und Morphologie den Zellstatus in vivo besser nachahmen und daher besser als Alternative für Tierversuchen geeignet sind. Allerdings wird oft vernachlässigt, geeignete Kulturbedingungen einzustellen, um in vivo Bedingungen für die Zellen zu schaffen. So werden Zellkulturen immer noch häufig unter Standard-Inkubatorbedingungen mit Luftsauerstoff und 5 % CO2 durchgeführt, was nicht unbedingt der typischen Sauerstoffkonzentration entspricht, der die Zellen im lebenden Gewebe ausgesetzt sind. Dies kann zu einem Zustand der Hyperoxie oder in einigen Fällen zu Hypoxie führen, was wiederum Stress für die Zellen bedeutet. Um die kultivierten Zellen mit Sauerstoffkonzentrationen zu versorgen, die den Bedingungen in vivo besser entsprechen, sind geeignete Messverfahren erforderlich. Viele Sauerstoffmessverfahren, wie z. B. Clark-Elektroden, verbrauchen während des Messvorgangs Sauerstoff und sind daher in kleinen Kulturen nicht anwendbar. Optische Sauerstoffsensoren hingegen verbrauchen keinen Sauerstoff, können miniaturisiert und in verschiedenen Ausführungen für unterschiedliche Anwendungen hergestellt werden, was diese Sensoren für die Überwachung von Zellkulturen immer beliebter macht. Optische Sensoren basieren auf Fluoreszenzfarbstoffen, die mit Sauerstoff reagieren und beispielsweise in Hydrogelen oder Nanopartikeln eingebaut werden können. Der Fluoreszenzfarbstoff kann auch in einem Polymerfilm immobilisiert werden, und es können sauerstoffempfindliche Sensorfolien hergestellt werden. Dies ermöglicht sogar die 2-dimensionale Aufzeichnung von Sauerstoffgradienten über einen ganzen Bereich mit einer entsprechenden Bildgebungskamera. Diese Methode wird bereits in vielen mikrofluidischen und Lab-on-a-Chip-Anwendungen eingesetzt. Hier beschreiben wir die Herstellung eines Mikrokavitätenarrays mit Sauerstoffsensorik auf der Basis einer optischen Sensorfolie. In diesen Mikrokavitäten können Sphäroide kultiviert werden, und Sauerstoff kann ungehindert aus dem darüber liegenden Medium in das 3D-Zellkonstrukt diffundieren, wodurch nahezu physioxische Bedingungen geschaffen werden. Der Sauerstoffgehalt in der Mikroumgebung mehrerer Sphäroide kann gleichzeitig mit der VisiSens Bildgebungstechnologie aufgezeichnet werden, was einen hohen Durchsatz und markierungsfreie Sauerstoffmessungen ermöglicht, ohne die 3D-Zellaggregate in irgendeiner Weise zu stören.
Sensorarrays mit der Fähigkeit zur Sauerstoffmessung
Für den Aufbau des Mikrokavitätensensorarrays wird eine 50 µm dicke Polycarbonatfolie mit einem sauerstoffempfindlichen Fluoreszenzfarbstoff beschichtet, der in ein Polymer eingebettet ist (PreSens GmbH). Diese Sensorfolie wird auf ein Messingformwerkzeug aufgelegt und die Mikrokavitätenarrays werden durch ein Mikrothermoforming-Verfahren (Karlsruher Institut für Technologie) hergestellt. Auf diese Weise lassen sich präzise Arrays mit einem inneren Mikrokavitätsdurchmesser von 300 µm und einer Fase mit 500 µm Außendurchmesser am oberen Ende herstellen (Abb. 2 A,B). Die Geometrie der Mikrostruktur ist nicht auf runde Kavitäten oder die hier genannten Abmessungen beschränkt und kann auf die Bedürfnisse des Kunden zugeschnitten werden. Eingepasst in CellCrown™ 12 NX (Scaffdex) Zellkultureinsätze sind die Mikrokavitäten-Sensorfolien im 12-Well-Format erhältlich (Abb. 2 C,D). In unserer Studie erwiesen sich die Sensorfolien als nicht toxisch für den verwendeten Zelltyp. Die Zellen wachsen direkt auf der sauerstoffempfindlichen Schicht; plasmabehandelte und kollagenbeschichtete Sensorfolien zeigen sogar ein verstärktes adhärentes Zellwachstum. Die Behandlung mit BIOFLOAT™ (FaCellitate) hingegen verhindert das adhärente Zellwachstum und ermöglicht die Bildung von Sphäroiden, indem die Zellen direkt in die Hohlräume pipettiert werden (Selbstorganisation). Dies bietet eine bequeme und direkte Möglichkeit, 3D-Zellaggregate zu erhalten.
Räumlich-zeitliche Sauerstoffmessungen in 3D-Kultur
Die Platten mit den Sensorarray-Einsätzen werden in einer Kammer über der Kamera platziert, und das VisiSens-System nimmt Sauerstoffbilder von unten auf (Abb. 4A). Auf diese Weise können Echtzeit-Sauerstoffmessungen über ganze Insertbereiche und eine Vielzahl von Sphäroiden durchgeführt werden. Im Gegensatz zu anderen derzeit erhältlichen 3D-Zellkultur-Überwachungssystemen bleiben bei diesem Aufbau die Mikrokavitäten während der Sphäroid-Kultivierung und der Messungen offen, so dass keine Gefahr einer Hypoxie besteht (Abb. 6). Es entsteht ein Sauerstoffgradient, der der O2-Diffusion aus dem Kulturmedium oberhalb der Mikrokavität in das Zellaggregat entspricht, was dem nativen Gefäßsystem in vivo entspricht. Die Diffusion ist nur von oben möglich, da die Sensormikrokavität von unten eine Diffusionsbarriere bildet (Abb. 5). Abbildung 7 zeigt ein Beispiel für ein Sauerstoffbild, das von einem Sensorarray mit insgesamt 120 Mikrokavitäten aufgenommen wurde. Interessante Bereiche können in der Mitte einer Mikrokavität, der längsten Sauerstoffdiffusionsstrecke durch die 3D-Zellkultur, und in den inneren und äußeren Abschrägungen, dem Diffusionsbereich, ausgewählt und verglichen werden. In einem Mikrokavitätenarray sind die Einzelmessungen unabhängig voneinander, da der Gradient in jede Kavität einzeln gerichtet ist. Die jeweiligen Grenzschichten werden durch das darüber liegende Medium permanent mit O2 versorgt, identisch mit der Situation in vivo.
Neue Perspektive für viele Anwendungen
Diese Kulturplattform mit Sauerstoffsensorik bietet die Möglichkeit, die Auswirkungen von pharmazeutischen Wirkstoffen auf den Zellstoffwechsel zu testen. Da die Mikrokavitäten die Bildung von 3D-Zellaggregaten in hoher Anzahl - bis zu 1400 Sphäroide in einer 12-Well-Platte - erleichtern, ist diese Methode nicht nur zeitsparend für Assays, sondern ermöglicht auch die Erstellung einer großen Menge von Daten zum Vergleich. Da die Zellen während des Messvorgangs nicht verändert werden, können sie sogar für die nachfolgende Verarbeitung/Analyse verwendet werden. In ersten Proof-of-Concept-Experimenten wurde dieser Aufbau für mitochondriale Stresstests verwendet, und nach Zugabe der jeweiligen Testsubstanzen konnten die erwarteten Sauerstoffkonzentrationen in den 3D-Zellkulturen nachgewiesen werden (Abb. 8). Derzeit werden Protokolle für Kardiotoxizitätstests von pharmazeutischen Wirkstoffen mit dem Mikrokavitätensensor-Array entwickelt.