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Sauerstoffverbrauchsraten einer Monolayer anhaftender MDCK II Zellen

Ein Vergleich von offenen und geschlossenen Systemen mit dem VisiSens TD Imaging System

C. Schmittlein1, R. J. Meier2, J. Wegener1
1Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik, Universität Regensburg, Regensburg, Deutschland
2PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Deutschland

Sauerstoff ist ein Molekül von größter Bedeutung für biologische Systeme, da er lebensnotwendig ist, aber auch schädliche Auswirkungen haben kann. Daher ist die lokale O2-Konzentration ein wichtiger analytischer Parameter zur Beschreibung der Bedingungen und der Stoffwechselaktivität von Biosystemen. Die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) von Zellen und Geweben kann z.B. als Ersatzparameter für die Untersuchung der Wirkung von Drogen angewandt werden. In diesem Bericht zeigen wir, wie optische O2 Sensoren und das VisiSens™ Imagingsystem zur Untersuchung der OCR in offenen und geschlossenen Gefäßen verwendet werden können.

Material & Methoden

Messungen des zellulären O2-Verbrauchs wurden mit dem VisiSens TD Bildgebungssystem zusammen mit SF-RPSu4-Sauerstoffsensoren durchgeführt. Runde Stücke der planaren O2-empfindlichen Sensorfolien mit 9,6 cm² wurden auf den Boden transparenter Kunststoffgefäße geklebt. Die optische Isolationsschicht (OIW) wurde zur besseren Zelladhäsion von den Sensorfolien entfernt. Die Sensorgefäße wurden 1 Minute lang Argonplasma ausgesetzt, um die Oberfläche vor dem Aussäen der Zellen zu reinigen und zu sterilisieren. Die Zweipunktkalibrierung der O2-Sensoren wurde mit Zellkulturmedien mit 0% und 100% Luftsättigung durchgeführt. Die Kalibrierwerte wurden mit der PreSens Oxygen Calculator Software von % Luftsättigung in Torr umgewandelt. Die automatisierte Zeitreihenaufzeichnung und Auswertung der Bilder erfolgte mit der VisiSens ScientifiCal Software. Der zellzahlabhängige O2-Verbrauch von MDCK II-Zellen wurde in luftdichten Gefäßen (kein O2-Zufluss) mit 9,6 ml L-15-Medium aufgezeichnet. Die Gefäße wurden mit einem speziell angefertigten luftdichten Deckel verschlossen, der mit Blu-Tack® befestigt wurde. Um sicherzustellen, dass die experimentellen Respirationswerte ausschließlich vom mittleren Volumen und nicht vom Vorhandensein einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche abhängen, die eine zusätzliche Diffusion von Sauerstoff ermöglicht, wurden die Gefäße unter Ausschluss des Kopfraums vollständig mit Medien gefüllt. Für Vergleichsexperimente wurden drei Kultivierungskammern mit unterschiedlichen Höhen und damit Medienvolumen mit einem offenen System mit Luftraum verglichen. Die Volumina der geschlossenen Systeme lagen im Bereich von 4,8 bis 19,2 ml, das offene System enthielt ein Volumen von 4,8 ml. Sowohl offene als auch geschlossene Systeme hatten eine identische Wachstumsfläche von 9,6 cm². MDCK II-Zellen wurden 24 Stunden vor Durchführung der Sauerstoffmessungen mit einer Dichte von 4,5 × 105 Zellen cm–2 ausgesät. Der Sauerstoffverbrauch wurde in L-15-Medium bei 37 ° C in einem Inkubator unter Wachstumsbedingungen überwacht. Die scheinbare Sauerstoffverbrauchsrate (AOCR) für geschlossene Systeme wurde durch lineare Anpassung der pO2-Abnahme als Funktion der Zeit bestimmt.

y = A + Bx

wobei -B den AOCR ergibt. Die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) für offene Systeme wurde mit der folgenden Gleichung berechnet:

Dabei ist D der Diffusionskoeffizient von O2 in Wasser (3,3 10-5 cm2 s-1), S der zellbedeckte Bereich der Petrischale (9,6 cm2), α der Löslichkeitskoeffizient bei 37 °C (0,94 µmol cm-3 atm-1), h die Höhe der Mediumsäule (0,5 cm), pO2 (h) der Sauerstoffpartialdruck auf der Höhe der Zellschicht und pO2 (0) der Sauerstoffpartialdruck auf der Medienoberfläche bestimmt bei t = 5 h.

Ergebnisse

Zunächst wurden Sauerstoffverbrauchsprofile der MDCK II-Nierenzelllinie in Abhängigkeit von der Zellinokulationsdichte aufgezeichnet. MDCK II-Zellen wurden mit fünf verschiedenen Zelldichten, die von konfluenten bis zu stark subkonfluenten Zellschichten reichten, auf die Sauerstoffsensorfolien ausgesät. 24 h nach der Zellinokulation wurde der Sauerstoffverbrauch von MDCK II-Zellen in 9,6 ml L-15-Medium bei anfänglicher 100% iger Luftsättigung in einem geschlossenen System über die Zeit verfolgt. Abb. 2 zeigt die Abnahme des pO2 in den Medien in Abhängigkeit von der anfänglichen Zellkeimdichte (Kurven: Mittelwert und SD von drei einzelnen Experimenten). O2 in den Medien wird im Laufe der Zeit von den atmenden Zellen verbraucht. Die beiden höchsten Zelldichten zeigen lediglich eine lineare Sauerstoffabnahme. Bei geringerer anfänglicher Zelldichte zeigt die Kurvenform eine stärkere Krümmung, aufgrund der Zellteilung und einer kontinuierlichen Zunahme der atmenden Zellen auf der Sensoroberfläche. Offensichtliche Sauerstoffverbrauchsraten (AOCRs) und entsprechende Sauerstoffverbrauchsraten sind in Abb. 2 zusammengefasst.

Darüber hinaus wurden konfluente MDCK II-Zellen in offenen oder geschlossenen Systemen kultiviert. Wie erwartet nahm der pO2 unterhalb der Epithelschicht mit abnehmendem Mediumvolumen in geschlossenen Systemen schneller ab. Der Sauerstoff war nach t = 1,75 h aufgebraucht, wenn die Zellen in einem geschlossenen System mit einem Volumen von 4,8 ml kultiviert wurden. Wenn das Volumen auf 9,6 ml verdoppelt wurde, fiel der pO2 innerhalb von t = 3,75 h ab und erreichte in 19,2 ml pO2 am Ende der 5 h Beobachtungszeit einen Wert von (30 ± 2 Torr). Im offenen System nahm pO2 zuerst linear auf (97 ± 11) Torr ab und erreichte dann stabile Werte von etwa 80 Torr, was einen Gleichgewichtszustand von O2-Eintrag und Atmung widerspiegelt. Abb. 3 zeigt den Vergleich der Sauerstoffverbrauchsraten in offenen und geschlossenen Systemen. Die O2-Profile geschlossener Systeme wurden angepasst und die offensichtlichen Sauerstoffverbrauchsraten (AOCRs) bestimmt.

Diskussion & Zusammenfassung

Sowohl die offene als auch die geschlossene OCR-Bestimmung haben ihre Stärken. Bestimmungen für geschlossene Systeme liefern genaue und schnelle Ergebnisse. Der Aufbau vereinfacht die Berechnung von OCRs, da der O2-Zufluss nicht berücksichtigt werden muss. OCRs können direkt durch lineare Anpassung der pO2-Änderungen über die Zeit, unter Berücksichtigung des verwendeten Volumens der Kammer, bestimmt werden. Die Volumina können an erwartete OCRs und mögliche Versuchszeiten angepasst werden. Wenn eine Zellmonoschicht unter statischen Bedingungen in einem offenen System kultiviert wird, erreicht gelöster O2 die anhaftenden Zellen nur durch Diffusion. Die Diffusion von O2 von der Gas-Medium-Grenzfläche zur Zellschicht wird durch das zweite Fick'sche Gesetz beschrieben. Unter der Annahme, dass Diffusion und Atmung ein Gleichgewicht erreichen und das Kulturgefäß für O2 undurchlässig ist, kann die OCR unter Verwendung von Gleichung 2 berechnet werden. Diese Methode ist technisch unkompliziert und ermöglicht die Untersuchung sequentiell zugegebener Testverbindungen, ist jedoch tatsächlich langsamer.

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