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pH und pO2 Imaging von bestrahlten Fibroblasten und oralen Plattenepithelkarzinomzellen

Duales Auslesen von pH und pO2 in 96 Well Platten mit VisiSens TD

Yvonne Reinders1, Robert J. Meier2, Gregor Liebsch2 and Frank Haubner3
1Klinik für Plastische, Ästhetische, Hand- und Wiederherstellungschirurgie, Universitätsklinikum Regensburg , Regensburg, Deutschland
2PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Germany
3Klinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde, Ludwig-Maximilians-Universität München, München, Deutschland

Eine der größten Herausforderungen in der Strahlentherapie ist die Beeinträchtigung von Gewebeheilungsprozessen. In diesem Zusammenhang zeigen chronische Wunden hypoxische Eigenschaften. Eine ausreichende Oxygenierung ist jedoch für die Zellproliferation, die Granulation, die Migration sowie die Proteinsynthese während der Gewebereparatur erforderlich. Darüber hinaus ist der pH-Wert besonders wichtig für die Signalgebung in schädigten Geweben und daher genau reguliert. In dieser Studie untersuchten wir die Auswirkungen von Bestrahlung auf verschiedene Zelltypen in in vitro Zellkultur. Wir verwendeten 96 Well Platten, die mit biokompatiblen pH und O2 Sensorfolien ausgestattet waren, zusammen mit zweidimensionaler Doppelanalyt-Auslesung mit dem VisiSens TD System. Trotz der üblichen Verwendung dieser optischen 2D Bildgebungssysteme für die Aufzeichnung zusammenhängender planarer Sensorflächen, wurde die Technik in dieser Studie dazu verwendet, mehrere kleinere Sensorfolien gleichzeitig auszulesen und in einem Datensatz aufzunehmen. Darüber hinaus ist das System in der Lage, Signale von Sensoren mit unterschiedlicher Sensorchemie, in diesem Fall planare pH und O2 Sensoren, im selben Experiment zu detektieren. Wir konnten unterschiedliche Empfindlichkeiten von Fibroblasten und oralen Plattenepithelkarzinomzellen beobachten, indem Sauerstoff- und pH-Unterschiede mit Proliferationsassays komplementiert wurden. Diese Studie hebt insbesondere die bedeutende Rolle von Sauerstoff nach Bestrahlung und den Unterschied in Proliferationsprozessen von bestrahlten und normalen Hautzellen im Gegensatz zu bestrahlten Tumorzellen hervor.

PreSens VisiSens TD Imaging Verfahren

Die Experimente in dieser Studie wurden unter Verwendung des VisiSens TD Systems mit dualem O2 und pH Imaging Softwaremodus durchgeführt, welches mehrere O2 und pH Sensorfolien gleichzeitig mit nur einem Gerät ausliest. Das Auslesen von mehr als einer Well Platte in einem Sichtbereich wurde mit dem Big Area Imaging Kit umgesetzt. Das System wurde in einem Inkubator installiert, um die Zellexperimente unter Wachstumsbedingungen durchzuführen (bei 37 °C, 5 % CO2, nicht kondensierend). Für die Zellmessungen wurde der Boden der Vertiefungen von schwarzen 96 Well Platten entweder mit biokompatiblen O2 oder pH Sensorfolien (SF-RPSu4 für O2, SF-HP5R für pH) bedeckt. Jede Well Platte enthielt 48 pH und 48 O2 Sensoren. Die mit dem Sensor ausgestatteten Well Platten wurden vor der Verwendung β-bestrahlt. Die Well Platten wurden auf eine Plexiglasplatte gelegt, die im Brutschrank montiert wurde, für optische Transparenz sorgte und die Well Platten in Position hielt. Der Abstand von Detektorlinse und Platte wurde auf ungefähr 20 cm eingestellt, um gleichzeitig zwei Well Platten in einem Sichtfeld aufzuzeichnen. Die externen Lichtquellen (Big Area Imaging Kit) wurden kreuzweise und in Dunkelfeldmodus positioniert. Die Kalibrierlösungen für die jeweiligen Sensorfolien wurden im selben Experiment in nicht verwendeten Wells der Platten aufgenommen. Die Kalibrierwells können benutzt werden um mögliche Signalabweichungen zu kompensieren, z. B. bei Messungen über längere Zeiträume, mit Temperaturänderungen oder unterschiedlicher Strahlungsbehandlung der Sensoren. Für die pO2-Kalibrierung wurdenTriplikate der Kalibrierlösungen Cal0 (0 % O2) und Cal100 (100 % Luftsättigung = 19,85 % O2 bei 5 % CO2, die mit luftgesättigten Zellkulturmedien bestimmt wurde) verwendet. Die Kalibrierkurve für den pH Sensor wurde unter Verwendung von 6 verschiedenen 50 mM Phosphat-gepufferten Medienlösungen von pH 5,0 bis pH 8,0 erzeugt, die in Vertiefungen jeder Platte pipettiert wurden. Beide verwendeten Sensormaterialien entsprachen dem physiologisch relevanten Messbereich für Zellkulturen.

Auslesen von pH und pO2

Das Auslesen der Sensoren erfolgte im dualen pO2-pH-Auslesemodus unter Verwendung der VisiSens ScientifiCal Software. Bilder wurden alle 30 Minuten in einem automatisierten Zeitreihen-Experiment über einen Zeitraum von 140 Stunden aufgenommen. Die Software nahm automatisch Bilder für O2 und pH  zu jedem Zeitpunkt auf. Die aufgezeichneten Rohbilder der pH und O2 Zeitreihen wurden in der Software verarbeitet, was zu Verhältnis(Ratio)-Karten oder kalibrierten Analytkarten führte. Ein Rauschfilter wurde verwendet, um Hintergrundsignale auszuschließen. Die Mittelwerte der Vertiefungen wurden ausgelesen, indem Regionen von Interesse (ROI) über eine Vertiefung oder mehrere Replikate ausgewählt wurden. Zeitabhängige Daten wurde über das "z-profiling"- oder das "multi-z-profiling"-Tool der Software ermittelt und nach Excel exportiert.

Zellkultur und Bestrahlung von NHFs und OSCCs

Humane dermale Fibroblasten (NHF) wurden in Dulbecco´s modifiziertem Eagle-Medium (DMEM; 4,5 g/l Glukose), ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin, gehalten. Die humane orale Plattenepithelkarzinom-Zelllinie PCI4 (OSCCs) wurde mit Zellen von einem männlichen Patienten, mit einem primären Karzinom an der Zungenwurzel, etabliert. OSCCs wurden in DMEM (1,0 g/l Glukose), ergänzt mit 10 % FBS und 1% Penicillin/Streptomycin, gehalten. Zellen aus Passage 3 - 6 wurden für die Experimente verwendet. Die Sensorfolien in den Wells wurden mit FCS beschichtet (I Stunde bei Raumtemperatur), um die Zelladhäsion an der Oberfläche zu erleichtern. In jeder Vertiefung wurden 10.000 Zellen verwendet. Die Experimente wurden mit n = 6 durchgeführt. Die Bestrahlung der Zellen erfolgte über einen Vorderzugang mit einem 6 MV Linearbeschleuniger (3 Gy pro min) bei Raumtemperatur, wie zuvor von Pohl et al. [1] beschrieben. Eine dosimetrische Bewertung wurde vorgenommen, um eine homogene Dosisverteilung zu gewährleisten. Die Zellen wurden mit Dosen von 2, 12 bzw. 20 Gy bestrahlt, da eine niedrige Dosis von 2 Gy vergleichbar ist mit der Standarddosis, die typischerweise bei Patienten pro Bestrahlung angewendet wird, und 12 Gy als Modell für eine hohe Dosis dienen sollten. 20 Gy fungierten als tödliche Dosis und somit als positive Kontrolle. Nicht bestrahlte Zellen unter gleichen Bedingungen dienten ebenfalls als Kontrolle.

Auswirkung der Bestrahlung auf pO2 und pH von NHFs und OSCCs

Um einen tieferen Einblick in die molekularen Prozesse bei der Bestrahlung von Zellen zu erhalten, wurde der Sauerstoffverbrauch von normalen dermalen Fibroblasten sowie von oralen Plattenepithelkarzinomzellen analysiert. Fibroblasten zeigten sowohl bei als auch ohne Bestrahlung einen leicht sinkenden Sauerstoffverbrauch. Dies deutet auf eine nur minimale Abnahme der Zelllebensfähigkeit in Folge von Bestrahlung hin. Im Gegensatz dazu zeigten orale Plattenepithelkarzinomzellen einen verminderten Sauerstoffverbrauch mit zunehmender Bestrahlungsdosis.

Um die Ergebnisse der Sauerstoffverbrauchsmessungen zu ergänzen, wurde auch der pH-Wert normaler dermaler Fibroblasten sowie der oralen Plattenepithelkarzinomzellen bestimmt. Im Gegensatz zu den pO2-Messungen konnten keine Unterschiede in der Reaktion von Fibroblasten und oralen Plattenepithelkarzinomzellen beobachtet werden. Beide Zelllinien zeigten im Zeitverlauf sowohl ohne als auch nach Bestrahlung einen eher stabilen pH-Wert.

Auswirkung der Bestrahlung auf die Proliferation von NHFs und OSCCs

Um die Wirkung der Bestrahlung auf Haut- und Krebszellen zu beobachten, wurden Fibroblasten und orale Plattenepithelkarzinomzellen in 96 Well Platten gezüchtet und mit 2 Gy, 12 Gy und 20 Gy bestrahlt. Die Proliferationsrate wurde unter Verwendung eines BrdU-Assays bestimmt (Abb. 6). Wir konnten zeigen, dass die Proliferation mit steigender Bestrahlungsintensität abnimmt. Hoch signifikante Effekte auf Fibroblasten zeigten sich für 2 Gy, 12 Gy sowie 20 Gy. Die Bestrahlung von oralen Plattenepithelkarzinomzellen hatte im Vergleich zu Fibroblasten eine reduzierte Wirkung. Dennoch wurde auch bei oralen Plattenepithelkarzinomzellen eine abnehmende Wirkung auf die Proliferation beobachtet, die für 12 Gy und 20 Gy signifikant war.

Zusammenfassung

Das VisiSens TD System ist in der Lage, O2 und pH Sensorfolien in zwei 96 Well Platten zu detektieren. Indem man die Zellen direkt auf der Sensorfläche wachsen lässt sind Messungen der Zellmikroumgebungen möglich, anstatt O2 und pH im Medium zu messen. Auf diese Weise können verschiedene Bestrahlungsbehandlungen mit verschiedenen Zelltypen in nur einem Experiment untersucht und die Ergebnisse direkt miteinander verglichen werden. Darüber hinaus können die Kalibrierdaten gleich während des Experiments mit aufgezeichnet werden und erlauben daher, Effekte der Bestrahlung auf die Sensorantwort zu kompensieren.

Referenz
[1] Pohl, F.; Hassel, S.; Nohe, A.; Flentje, M.; Knaus, P.; Sebald, W.; Koelbl, O., Radiation-induced suppression of the Bmp2 signal transduction pathway in the pluripotent mesenchymal stem cell line C2C12: an in vitro model for prevention of heterotopic ossification by radiotherapy. Radiat Res 2003, 159, (3), 345-50

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