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Prüfung der Lebensfähigkeit von Pflanzensamen durch Respirationsmessungen
Überwachung des Sauerstoffverbrauchs in 96-Well-Platten mit VisiSens TD und ViviPlate, einem neu entwickelten luftdichten Plattenklemmsystem
G. Liebsch & R. Meier
PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Deutschland
PreSens hat das Sensor- und Clamp-Tool ViviPlate entwickelt, mit dem geschlossene Respirationskammern unterschiedlicher Anzahl und Volumina im Mikrotiterplattenformat erzeugt werden können. Diese Kammern können dann parallel von oben mit unserem Bildgebungssystem VisiSens ausgelesen werden. Alle Kammern werden in einem Schritt durch Abdecken mit einer wiederverwendbaren, mit einem Sensor ausgestatteten, transparenten Sensorplatte verschlossen. Eine Versiegelungsplatte und eine Abdeckplatte mit Löchern an den Stellen der Wells/Vials und der Sensoren ermöglichen den optischen Zugang zu den fluoreszierenden optischen Sauerstoffsensoren von oben. Das Sandwich wird mit Rändelschrauben zusammengepresst, die eine Gegenplatte gegen die Abdeckplatte drücken und so eine luftdichte Versiegelung der einzelnen Wells/Vials gewährleisten.
ViviPlate ermöglicht die Prüfung der Viability (Lebensfähigkeit) und Vitalität mehrerer Proben durch Überwachung des sauerstoffverbrauchenden Energiestoffwechsels von Mikroorganismen, Geweben oder Zellen. Dazu ermittelt ViviPlate die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR). Durch Hinzunahme unserer CO2-Sensoren wird ViviPlate in Kürze in einer Produktversion verfügbar sein, die es erlaubt, den respiratorischen Quotienten (RQ) zu bestimmen.
In der folgenden Anwendung zeigen wir, wie dieses Instrument zur Prüfung der Lebensfähigkeit von Pflanzensamen in 96 Proben von vier verschiedenen Pflanzenarten eingesetzt werden kann. Während der Keimung verbrauchen Pflanzensamen Sauerstoff und die Atmung der Samen kann als Indikator für die Lebensfähigkeit verwendet werden. In unseren Experimenten haben wir das neue Sensor- und Klammersystem ViviPlate verwendet, das die Messung von Sauerstoff im Kopfraum von 96-Well-Platten ermöglicht. Pflanzensamen von vier verschiedenen Arten wurden in die 96-Well-Platten gegeben, einer in jede Vertiefung. Optische Sauerstoffsensoren wurden oben auf jeder Vertiefung positioniert, und das Klemmsystem sorgte dafür, dass die Platte und jede Vertiefung abgedichtet waren. Die Sauerstoffsensoren wurden mit dem VisiSens TD-System ausgelesen, mit dem alle 96 Sauerstoffsensoren in jeder Vertiefung in einem Bild erfasst werden können. Mit der VisiSens ScientifiCal Software konnte dann der Sauerstoffverbrauch aller Proben auf einem Bildschirm angezeigt werden.
Material & Methoden
Jede Vertiefung einer 96-Well-Standardplatte wurde mit 100 μL 1% Phytagel™ (Sigma-Aldrich®) gefüllt. In vier Abschnitten mit je 24 Vertiefungen wurde jeweils ein Samen von vier verschiedenen Pflanzenarten in jede Vertiefung gelegt (Kopfsalat, Brunnenkresse, Feldsalat und Weißkohl, Sperli GmbH; Abb. 3). Alle Vertiefungen der Mikrotiterplatte wurden mit einer Dichtung mit 96 Löchern und einer transparenten Platte mit angebrachten und vorpositionierten Sauerstoffsensorspots (SF-RPSu4, PreSens) verschlossen. Die 96-Well-Platte mit Dichtung und Sensorabdeckung wurde in eine speziell entwickelte Klammer (ViviPlate, PreSens) eingesetzt, die mit Rändelschrauben befestigt werden kann und einen gasdichten Verschluss der Wells gewährleistet. Die obere Klemmplatte hat an den Positionen über den Vertiefungen Löcher, so dass die Sauerstoffsensoren von oben ausgelesen werden können. Die fluoreszierenden optischen O2-Sensoren wurden mit dem VisiSens TD-Bildgebungssystem (PreSens) über einen Zeitraum von 3 Tagen in einem Abstand von 30 Minuten ausgelesen. Die Sauerstoffaufzeichnungen wurden mit der VisiSens ScientifiCal Software (PreSens) visualisiert und ausgewertet.
Lebensfähigkeit der Pflanzensamen
Abbildung 4 zeigt die Sauerstoffmessungen in der 96-Well-Platte nach 2 Tagen. Oben ist die Sauerstoffkonzentration in jeder Vertiefung in einer Farbdarstellung gezeigt. Die Farbskala wurde zwischen 0 und 120 % Luftsättigung eingestellt, wie rechts zu sehen ist. In einigen Vertiefungen lag die Sauerstoffkonzentration immer noch über 70 % Luftsättigung, was darauf hindeutet, dass die Samen darin erst später zu keimen begannen, verglichen mit den Samen in anderen Vertiefungen, in denen die O2-Konzentration bereits auf Werte zwischen 10 und 20 % Luftsättigung gesunken war. Die Software ermöglicht es, bestimmte Vertiefungen zusammenzufassen und die durchschnittliche O2-Konzentration in diesen Vertiefungen zu analysieren. Wir wählten die 24 Vertiefungen mit Salatsamen (dunkelblaues Rechteck) und die 24 Vertiefungen mit Weißkohlsamen (rotes Rechteck) aus und teilten sie in zwei Gruppen ein. Der Zeitverlauf der durchschnittlichen Sauerstoffkonzentration in diesen beiden Gruppen ist unten im Cumulated Data Graph in den jeweiligen Gruppenfarben dargestellt. Bei den Samen beider Arten begann die durchschnittliche O2-Konzentration kurz nach Beginn des Experiments zu sinken. In den ersten paar Stunden nahm der Sauerstoff langsamer ab, aber als die Keimung in allen Vertiefungen einsetzte, sank die durchschnittliche O2-Konzentration schneller. In Abbildung 5 sind die Ausgangs- und Endsauerstoffkonzentrationen in allen Vertiefungen dargestellt. Alle Samen keimten und verbrauchten den Sauerstoff im Kopfraum der Vertiefungen. In den meisten Vertiefungen war der Sauerstoff am Ende des Versuchs bereits vollständig verbraucht (0 % Luftsättigung).
Zusammenfassung
Mit der ViviPlate-Klammer und dem VisiSens TD Sauerstoff-Imaging-System konnten wir die Lebensfähigkeit von Pflanzensamen in 96 Proben parallel bewerten. Das System liefert Informationen über den Sauerstoffgehalt in jeder einzelnen Vertiefung einer 96-Well-Mikrotiterplatte, und nicht keimende Samen können leicht identifiziert werden. Die ViviPlate-Klammer verschließt die Vertiefungen sicher, so dass präzise Atmungsmessungen durchgeführt werden können. Das System ist das ideale Werkzeug für die gleichzeitige Sauerstoffüberwachung in einer Vielzahl von Proben.