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Qualitätsbewertung von primären humanen Keratinozyten-Kulturen
Online-Messung von Sauerstoff und pH mit dem SDR SensorDish® Reader
V. Lorenz, B. Roski, A. Hermann, und H. F. Abts
Celonic GmbH, Jülich, Deutschland
Der SDR SensorDish® Reader ermöglicht die nicht-invasive Analyse von gelöstem Sauerstoff (DO) und pH in Multiwell-Platten. In dieser Studie wurde die Empfindlichkeit des Überwachungsgeräts in Zellkultur mit Keratinozyten (Zelllinie und Primärzellen) getestet, die eine vergleichsweise geringe metabolische Aktivität aufweisen. Darüber hinaus wurde untersucht, wie sich die Zellproliferation auf die O2- und pH-Werte in den Kulturen auswirkt. Die Korrelation zwischen der mit Lichtmikroskopie analysierten Zellproliferation, dem Anstieg des Sauerstoffverbrauchs und einer Abnahme des pH-Werts im Kulturmedium war in den mit dem SDR aufgezeichneten Daten klar ersichtlich. Die Sauerstoff- und pH-Kinetik lieferte wertvolle Informationen über Kulturqualität und -effizienz und beweist die Eignung des SDR SensorDish® Readers zur Überwachung der Zellkulturleistung.
In vitro-Tests sind Standard-Screening-Verfahren in dermatologischen und kosmetischen Laboratorien. Neue pharmakologische Substanzen können in Kulturgefäßen unter definierten Bedingungen auf ihre Wirksamkeit getestet und quantitativ bewertet werden. In vitro kultivierte epidermale Keratinozyten gewinnen auch in der medizinischen Forschung, insbesondere im Tissue Engineering, zunehmend an Bedeutung - z. B. bei der Transplantation von kultivierten autologen Hautzellen zur Behandlung von Verbrennungen, was bemerkenswerte Erfolgsraten zeigt. Eine effiziente und zuverlässige in vitro Zellvermehrung ist daher äußerst wichtig, und moderne Überwachungs- und Kontrollsysteme werden angewendet, um die Reproduzierbarkeit und Qualität der Zellkulturen sicherzustellen. Der PreSens SensorDish® Reader ist ein nicht-invasives, optosensorisches Überwachungssystem zur Langzeitmessung von Sauerstoff und pH in Multiwellplatten mit integrierten Sensoren. Sogar minimale Änderungen in einem der beiden wichtigen Wachstumsparameter können detektiert werden. Die herausragende Leistungsfähigkeit dieses Systems wurde bereits in Vorstudien nachgewiesen. Der hier beschriebene Test konzentriert sich auf die Empfindlichkeit des SDR-Systems, wenn es mit Zellen verwendet wird, die eine vergleichsweise geringe metabolische Aktivität zeigen, sowie auf den Zusammenhang von Zellproliferation und Sauerstoffverbrauchsraten oder Änderungen der pH-Werte.
Material & Methoden
Eine spontan immortalisierte menschliche Keratinozyten-Zellinie (HaCaT-Zellen) und primäre menschliche Keratinozyten wurden für diese Experimente verwendet. Beide Zelltypen haben eine kritische minimale Zelldichte für die Inokulation. Wenn dieser minimale Wert der Zelldichte nicht erreicht wird, verlangsamt sich das Zellwachstum oder es findet überhaupt kein Wachstum statt. Beide Zelltypen wurden parallel mit vier verschiedenen Startzelldichten von 2 × 103, 1,9 × 104, 6,7 × 104 und 3,8 × 105 Zellen / Well kultiviert. Referenzmessungen wurden in zellfreien Proben durchgeführt. Als Kultivierungsgefäße verwendeten wir 24-Well Oxo- und HydroDishes® von PreSens die mit dem SDR SensorDish® Reader ausgelesen wurden. Die Oberfläche der 24-Well Platten wurde für die Experimente mit Kollagen beschichtet, und für jede Zelldichte ein Well online mit dem SDR analysiert. Die Kulturdauer betrug 12 Tage. Die Kultivierung fand unter Standardbedingungen in 5 % CO2 Atmosphäre mit definiertem Serum-freiem Keratinozyten-Medium (Gibco Defined Keratinocyte-SFM) statt. Das Medium wurde jeden Tag durch äquilibriertes, frisches Medium ersetzt.
Messung in HaCaT-Zellkultur
Messungen in Kulturen epidermaler HaCaT-Zellen wurden als Referenz für primäre Keratinozyten verwendet. Die Sensitivität des SDR-Systems erlaubte es, auch kleinste Veränderungen in den kaum metabolisch aktiven HaCaT-Zellen zu detektieren - selbst bei Ausgangszelldichten von nur 1,9 x 104 Zellen/Well (Abb. 2). Messungen in geringere Anfangszelldichten zeigten keinen Unterschied zu Werten, die in den zellfreien Kontroll-Wells ermittelt wurden. Eine kontinuierlich ansteigende Sauerstoffverbrauchsrate konnte für die mit 6,7 x 104 Zellen/Well angeimpfte Zellkultur gemessen werden. An Tag 6 erreichte diese Kultur die gleichen DO-Werte wie die Kultur, die mit der höchsten Zelldichte angesetzt worden war. Daher ist die ideale Ausgangszelldichte für HaCaT-Kultur 6,7 × 104 Zellen/Well. Die schnelle Abnahme der DO-Konzentration auf Minimalwerte, innerhalb weniger Stunden nach dem Medienwechsel, lässt auf eine hohe Proliferation und metabolische Aktivität schließen. Die gleichzeitig aufgezeichneten pH-Werte lieferten ähnliche Ergebnisse (Abb. 2). Die Abnahme der pH-Werte korrelierte eng mit der jeweiligen Ausgangszelldichte. Die pH-Werte nahmen über die gesamte Kulturdauer von 12 Tagen kontinuierlich ab. Kulturen mit der höchsten Ausgangszelldichte zeigten nach 12 Tagen Kultivierung einen pH-Wert von 6,8. Im Gegensatz zur DO-Kinetik konnten Unterschiede, die auf der Ausgangszelldichte beruhten, gegen Ende der Kultivierungsperiode noch deutlich nachgewiesen werden. Die Zellproliferation wurde nach 3 und 12 Tagen der Kultivierung analysiert (Abb. 1A) und korrelierte mit den SDR-Messungen.
DO- und pH-Kinetik von primären Keratinozyten
Der Sauerstoffverbrauch in primären Keratinozyten (Abb. 3) war zu Beginn der Kultivierung ähnlich dem von HaCaT-Zellen, zeigte jedoch mit fortlaufender Kultivierungsdauer deutliche Unterschiede. Die Probe mit der niedrigeren Ausgangszelldichte von 2 x 103 Zellen/Well zeigte im Gegensatz zu den HaCaT-Zellen ab dem 7. Tag signifikante metabolische Aktivität. Primäre Keratinozyten können niedrigere Anfangszelldichten als die HaCaT-Zellen tolerieren. Kulturen mit hohen Ausgangszelldichten erreichten nach nur 3 Tagen ein Minimum an gelöstem Sauerstoff (DO) von 22 %. Nach einem anfänglichen Minimum von 10 % konnte am 1. Tag ein Aufwärtstrend festgestellt werden. Im Unterschied zur HaCaT-Zellkultur setzte sich dieser Anstieg nach dem 5. Tag fort. Die DO-Werte stabilisierten sich nach jedem Medienwechsel auf einem höheren Niveau. Gegen Ende der Kultivierungsdauer erreichte das DO-Niveau einen Wert von 70 % Luftsättigung. Andere Zellkonzentrationen zeigten die gleiche Tendenz mit einem 3-tägigen Aufschub. Dies ist ein signifikanter Unterschied zu den gemessenen Werten in HaCaT-Zellkulturen, was den Schluss zulässt, dass primäre Keratinozyten ihre metabolische Aktivität allmählich reduzieren. Die merkliche Abnahme des Sauerstoffverbrauchs steht jedoch nicht in Zusammenhang mit einer Reduktion der lebensfähigen Zellzahlen (Abb. 1 B). Primäre Keratinozyten zeigen im Vergleich zu den HaCaT-Zellen eine deutliche Kontaktinhibierung. Nach der Bildung einer Monoschicht hören die Zellen auf sich zu vermehren und der Stoffwechsel wird reduziert. Ein weiterer Grund können die durch hohe Zelldichten bedingte limitierenden Kulturbedingungen sein, auf die primäre Keratinozyten empfindlicher reagieren als HaCaT-Zellen. Die pH-Kinetik (Abb. 3) für verschiedene Inokulationsgrößen zeigte die gleiche Tendenz wie die DO-Kinetik. In allen Kulturen nahmen die pH-Werte nach jeder Medienänderung ab, jedoch reduzierte sich diese Abnahme ab dem 8. Tag. Selbst in der Kultur mit der niedrigsten Ausgangszelldichte konnte nach dem 7. Tag eine pH-Wert-Abnahme festgestellt werden, die bis zum Ende der Kultivierungszeit größer wurde. Diese Effekte hingen mit der Zellzahl und der Aktivität der primären Keratinozyten zusammen und waren gegen Ende der Kultivierungsdauer am offensichtlichsten. Auch in diesem Fall betrug die ideale Ausgangszelldichte 6,7 x 104 Zellen/Well.
Zusammenfassung
Ein genauer Einblick in die Stoffwechselbedingungen innerhalb der Kulturgefäße ermöglicht neue und vielversprechende Perspektiven bei der Optimierung von Zellkulturprozessen. Die aufgezeichnete Kinetik zeigt, dass das SDR-System ideal zur Überwachung sensitiver Keratinozytenkulturen geeignet ist. Bereits bei niedrigen Anfangszelldichten lassen sich DO- und pH-Kinetik eindeutig bestimmen. Mit diesen Grafiken können detaillierte Aussagen zur Kulturentwicklung abgeleitet werden. Auf diese Weise lassen sich entsprechend der Prozessziele definierte Kultivierungszeiten festlegen, in denen Kulturen optimale physiologische Bedingungen aufweisen, um zum Beispiel für die weitere Verwendung in der Transplantation oder für pharmazeutische Screening-Tests eingesetzt zu werden. Zukünftige Hochskalierungsprozesse lassen sich auf den mit dem SDR im 24-Well-Format gesammelten Ergebnissen aufbauen.