SFR vario

E. coli K12 zeigt deutliche Diauxie in Glukose und Laktose enthaltendem Medium, die mit dem SFR vario überwacht werden konnte. Die Messungen wurden mehrmals für die Offline-Probenahme gestoppt - um die Substratkonzentration zu bestimmen - was sich durch Lücken in den Graphen zeigt. In der ersten Wachstumsphase wird Glukose verbraucht (1). Das System zeigt eine geringere Genauigkeit im unteren Biomassebereich, dies verbessert sich jedoch mit zunehmender Zelldichte. Während die von den Bakterien produzierte Essigsäure den pH-Wert des Mediums senkt, weist die auf 10 % a. s. sinkende Sauerstoffkonzentration auf eine hohe metabolische Aktivität hin. Als die Glukosekonzentration nach etwa 6 Stunden unter 0,1 g l^-1 fällt (offline bestimmt, Daten werden hier nicht gezeigt), stoppt das Wachstum und der Sauerstoffgehalt steigt schnell an. Dies zeigt sich auch in einem kleinen Plateau (gezoomter Bereich) in der online gemessenen Biomassekurve (2). Während dieser Phase passen die Bakterien ihren Stoffwechsel an Laktose an. Die Aufzeichnung dieser genauen Übereinstimmung im Hinblick auf Sauerstoffverbrauch und Wachstum konnte nur mit dem neuen Online-Überwachungssystem realisiert werden. In der dritten Phase wächst E. coli auf Laktose, bis diese aufgebraucht ist, und die Kultur in die stationäre Phase übergeht (3).

K. marxianus zeigen zwei Wachstumsphasen in Schüttelkolben-Kultur mit Glukose als Substrat. In der ersten Phase wird Glukose unter aeroben Bedingungen (1) umgewandelt und der Sauerstoffgehalt sinkt kontinuierlich auf unter 5 % a. s. Aufgrund von Stoffwechselprodukten sinkt der pH-Wert von 7 auf 6,1. Nach 9 Stunden Kultivierungszeit ist die Glukose vollständig verbraucht (offline bestimmt, Daten hier nicht gezeigt), und der pH-Wert steigt wieder an. Während der zweiten - sauerstofflimitierten - Phase zeigt K. marxianus ein signifikant langsameres Wachstum, was deutlich in den Streulichtmessungen (= Biomasse) (2) beobachtet werden kann, während die in der ersten Phase erzeugten Glukoseprodukte unter hohem Sauerstoffbedarf umgewandelt werden. Die gleichzeitige Überwachung von Sauerstoff, pH und Biomasse mit dem SFR vario bietet völlig neue Möglichkeiten bei der Kulturbeobachtung und Auswertung von Stoffwechselprozessen.

Die Messung der Sauerstoffaufnahmerate von Mikroorganismen ist ein sehr guter Indikator für die metabolische Aktivität. Sie wird u. a. verwendet, um den Wachstumszustand vorherzusagen oder die Geschwindigkeit zu bewerten, mit der metabolische Prozesse stattfinden. Die Grafik auf der linken Seite zeigt die OUR (Sauerstoffaufnahmerate) von S. cerevisiae in YPD-Medium während der Kultivierung im Schüttelkolben. Die Sauerstoffaufnahmerate steigt während der ersten Stunden der Kultivierung aufgrund des exponentiellen Wachstums beständig an. Ein kurzer Abfall der Aufnahmerate zeigt an, dass das Substrat weniger wird und die Mikroorganismen die metabolische Aktivität reduzieren, während sie ein anderes Substrat verstoffwechseln. Dann setzt eine weitere exponentielle Wachstumsphase ein. Der Zeitraum der maximalen Stoffwechselaktivität mit der höchsten OUR als auch der Zeitpunkt, an dem die stationäre Phase einsetzt (aufgrund der Sauerstofflimitierung) und die OUR abrupt auf Minimalwerte abfällt, kann mit der Grafik eindeutig bestimmt werden.

Anton Glieder und seine Kollegen von bisy e. U. und dem Institut für Molekulare Biologie der Technischen Hochschule Graz haben einen Videoartikel veröffentlicht (J. Vis. Exp. (143), e58589 (2019)), der ein einfaches Schüttelkolben-Kultivierungssystem für Methanol-freie Expression durch P. pastoris beschreibt. Online Monitoring mit dem SFR vario und konstante langsame Fütterung mit Glyzerin wurden verwendet um Bioreaktorbedingungen zu simulieren. Diese Herangehensweise trug dazu bei Bioreaktorbedingungen näher zu kommen, als das bei den meisten kleinformatigen Batch-Kultivierungen der Fall ist.

Sehen Sie sich das VIDEO auf https://www.jove.com/video/58589/ an!